CN119488586A 制备免疫原性组合物的方法 （勃林格殷格翰动物保健美国有限公司）

201980021798.92019.03.25司本发明涉及制备展现降低的杀病毒活性的提供具有第一液体及重组蛋白的混合物，(b)通过从所述混合物去除所述第一液体的一部分而浓缩所述混合物中的重组蛋白，及(c)通过连续渗滤处理从步骤(b)产生的溶液。本发明可以实现以较大规模且甚至以极大规模制备具有降低的杀病毒效应的包含重组蛋白的免疫原性组合2重组PCV2ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2ORF2蛋白的病毒样颗粒，(b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物中的一包含编码所述重组PCV2ORF2蛋白的核酸序列的载体，其中所述载体已被灭活剂灭中和剂，3.一种制备包含重组PCV2ORF2蛋白的免疫原(b)通过从步骤(a)(iii)产生的混的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述混36.权利要求4或5的方法，其中所述至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少和/或其中所述滤膜具有小于所述重组PCV2ORF2蛋白和/或所述病毒样颗粒的平均孔和/或其中所述滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或其中所述滤膜任选地是基于步骤(iii)在第一容器中进行，且其中由中和所述灭活剂产生的混合物从所在步骤(b)中，使所述混合物循环穿过所述第二容器及所述过滤器系统，直在步骤(c)中，打开所述第一容器与所述第二容器之间的所述阀，且将9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述第一液体和/或其中在步骤(b)中，与从步骤(a)产生的所述混合物的体积相比，所述重组和/或其中在步骤(c)中，添加至所述总体流的所述第二液体的总体积是从步骤(b)产述第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a)产生的4或所述病毒样颗粒结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物中所述PCV2ORF212.权利要求1至11中任一项的方法，和/或其中所述中和剂是硫代硫酸钠和/或其中所述中和剂相对于所述灭活剂以摩尔14.权利要求1至13中任一项的方法，其中与未经历所述方法的步骤(b)的浓缩及步骤(c)的连续渗滤的免疫原性组合物混合物相比，由所述方法产生的所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少20和/或其中当活病毒与通过所述方法产生的所述免疫原性组合15.权利要求1至14中任一项的方法，其中所述方法进一步包含将步骤(c)和/或步骤和/或其中所述至少一种额外抗原优选是猪繁殖和呼吸综合征_重组PCV2ORF2蛋白，其优选包含与SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的序列具有至少且其中优选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不含中18.权利要求16或17的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物进一步包含减毒的和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对和/或其中在施用一个剂量的所述免疫原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对5选减毒的PRRS病毒以及减毒的活细菌的额20.权利要求16至18中任一项的免疫原性组合21.权利要求16至18及20中任一项的免疫原性组合物和/或权利要求19或20的试剂盒，6[0001]本发明涉及制备免疫原性组合物的方法以及展现降低的杀病毒活性的这些免疫灶的严重性之间存在强烈的相关性。经PCV2感染的猪的死亡率可接近80％。除了PMWS外，PCV2也与其他若干感染相关，包括伪狂犬病、猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)、格拉氏病[0003]有若干疫苗可用于降低猪中PCV2感染的影响。美国专利基于ORF2的亚单位疫苗也描述于WO07/28823[0005]针对PCV2的免疫原性组合物及针对其他病原体的各种免疫原性组合物通常对其些杀病毒活性，但当与免疫原性组合物的其他组分组合时，此杀病毒活性不可导致超过[0006]为此，WO11/28888提供降低包含PCV2抗原的组合物的杀病毒活性7[0008]ii)通过利用过滤器的过滤步骤从包含ORF2蛋白的病毒样颗粒的PCV2抗原去除第[0010]b)通过去除第一及第二液体的一部分，将PCV_2抗原浓缩至相对于第一液体体积[0020](b)通过从混合物去除第一液体的一部分浓缩从步骤(a)产生的混合物中的重组[0021](c)通过连续渗滤、特别地通过用第二液体连续渗滤处理从[0024]在一个优选方面中，步骤(a)的混合物另外含有包含编码所述重组蛋白的核酸序或8地，第一液体包含用于在培养的宿主细胞中制备重组蛋白的细胞培养基或优选由其组成。9体包含细胞培养基的部分或由细胞培养基组成，且其中细胞培养基优选是昆虫细胞培养常将编码表达蛋白质的DNA插入合适的表达载体中，所述载体进而用于转化或在病毒载体合在一起的DNA区段的DNA分子。用于制备重组蛋白的合适系统包括(但不限于)昆虫细胞(例如杆状病毒)、原核系统(例如大肠杆菌(Escherichiacoli))、酵母(例如酿酒酵母可通过本领域技术人员已知的化学和/或物理处理来进行。优选的灭活剂包括环化二乙烯以1.0M添加硫代硫酸钠溶液以中和任何残余BEI，且可将灭活/中和的收获流体冷冻储存体(或重组体)进行表达的方法尤其可通过以下所公开的方法或类似于以下所公开的方法WO95/30018；Paoletti,“Applicationsofpoxvirusvectorstovaccination:Anupdate”,PNASUSA93:11349_11353，1996年10月；Moss,“Geneticallyengineeredpoxvirusesforrecombinantgeneexpression,vaccination,andsafety”,PNASUSA93:11341_11348，1996年10月；Smith等人，美国专利第4,745,051号(重组杆状病毒)；Protocols”(1995HumanaPressInc.)；Smith等人，“ProductionofHumanBetaInterferoninInsectCellsInfectedwithaBaculovirusExpressionVector”,functionofherpessimplexvirusgenes:Aprimerforgeneticengineeringofnovelvectors”,PNASUSA93:11307_11312,1996年10月；Andreansky等人，“Theapplicationofgeneticallyengineeredherpessimplex93:11334_11340,1996年10月；Frolov等人，“AlStrategiesandapplications权的美国申请案系列第08/675,556号及第08/675,566号，二者组腺病毒)；Grunhaus等人，1992,“Adenovirusascloningvectors”,SeminarsinVirology(第3卷)第237_52页,1993；Ballay等人EMBOJournal,第4卷，第3861_65页,McClements等人，“ImmunizationwithDNAvaccinesencodingglycoproteinDorglycoproteinB,aloneorincombination,inducesprotectiveimmunityinanimalmodelsofherpessimplexvirus_2disease”,PNASUSA93:11414_11420,1Diego,CA)，特别地在生产细胞是昆虫细胞的情况下提供。尽管杆状病毒表达系统是体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述[0065]_将混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中至少一个过滤器包[0068]_将溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中至少一个过滤器包含滤膜，该滤膜具有允许经中和的灭活剂和/或中和剂穿过、同时保留总体流中的重组蛋白[0072]优选地，本文所述的至少一个过滤器是至少一个平板过滤器和/或至少一个中空[0074]如本文所述的滤膜优选具有比重组蛋白小和/或比所述四级结构小的平均孔径，[0076]和/或滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或滤膜任选地是基于稳定纤维素的比或与从步骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩3X至骤(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述(iii)产生的混合物的体积相比，重组蛋白或所述四级结构分别浓缩至少10X、例如10X至中的第二液体的总体积最优选是大约从步骤(a及其组合的又一组分混合，且其中从所述混合产生的溶液中重组蛋白的浓度和/或所述四级结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的混合物中重组蛋白和/或所述四级结构的浓度或低于从步骤(a)产生的混合物中重组蛋白和/或所述四级结[0091]如本文所用的“佐剂”可包括氢氧化铝及磷酸铝；皂苷，例如QuilA、QS_21(CambridgeBiotechInc.,CambridgeMA)、GTheTheoryandPracticalApplicationofAdjuvants(编辑Stewart_Tull,D.E.S.)Approach”,PlenumPress,1995的第147页上描述的SPT乳液以及同一本书第183页上描述[0092]佐剂的又一实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物及马来酸酐与烯基衍生物效防止感兴趣的组合物的任何微生物污染或抑制感兴趣的组合物内的任何微生物生长的[0100](1)允许用包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，[0101](2)其后从细胞培养基中回收重组蛋白和/或包含多个所[0105]优选的细胞是易受含有重组蛋白DNA并表达重组蛋白的适当重组病毒载体感染的那些。优选地，细胞是昆虫细胞，且更优选地，其包括以商标SF+昆虫细胞(Protein[0106]当用于感染易感细胞时，包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体的感染复数组蛋白DNA且表达重组蛋白的重组病毒载体感染0.35_1.9×106个细胞/mL、仍更优选约核苷酸序列之间的相同性。参见(例如)Lesk编辑，ComputationalMolecularBiology,OxfordUniversityPress,NewYork,(1988)；Smith编辑，Biocomputing:InformaticsAndGenomeProjects,AcademicPress,NewYork,(1993)；Griffin&Griffin编辑，ComputerAnalysisOfSequenceData,PartI,HHeinje,SequenceAnalysisInMolecularBiology,AcademicPress,(1987)；以及Gribskov及Devereux编辑，SequenceAnalysisPrimer,MStocktonPress,NewYork,等人，Nuc.AcidsRes.)12:387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，J.Molec.Biol.215:403(1990))、及Bestfit程GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,Wis.53711)，其使用Smith及Waterman的局部同源性算法(Adv.App.Math.,2:482_489开放罚分为_12且空位延伸罚分为_2。出于本发明的目的，使用ClustalW方法以DNASTARInc.的MegAlign软件软件版本11.1.0(59)，419使用程序中设定的默认多重比对参数(％)＝30％)比对蛋白质/氨基酸序列。蛋白质生物合成和/或蛋白质加工(优选选自糖基化、磷酸化及乙酰化)中影响的氨基酸残基的修饰的序列。组蛋白的所述四级结构是包含多个重组PCV2ORF2毒活性降低至少20和/或其中当活病毒与通过所述方法产生的免疫原性组合物混合4小均)23℃。包含将步骤(c)和/或步骤(d)后保留的混合物与至少一种额外抗原组合的步骤，其中至少[0121]根据特定优选方面，所述免疫原性组合物是包含1_10μML_精氨酸和/或1_10μM[0123]_重组PCV2ORF2蛋白，优选由[0125]且其中任选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不[0127]特别地，从步骤(d)产生的免疫原性组合物或混合物每毫升包含4_400μg重组[0128]“基本上不含中和剂”特别应理解为意指免疫原性组合物包含小于150nM的中和疫原性组合物，其中从步骤(d)产生的免疫原性组合物或混合物基本上不含硫代硫酸钠或可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得的免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物包含温进行二维(2D)超高效液相色谱(UPLC)时展现峰A面积对峰B面积的比率为0.2_0.4和/或[0157]_以0.6mL/min的流速驱动0分钟时初始100％50mMTris(pH8)及2.5％50mMTris、2MNaCl(pH8)且最终2分钟时至10％50mMTris(pH[0159]色谱的第二维，其中以0.3m有1.75mL柱体积与450A的孔径的尺寸排阻柱，例如，倘若所述样品包含步骤(c)后保留的免疫原性组合物，则样品优选包含1:10稀释于50mMTris(pH8)中的免疫原性组合物或由1:10稀释于50mMTris(pH8)中的免疫原性组不限于)以下效应中之一或多者：产生或活化特异性地针对感兴趣的组合物或疫苗中所包或缺乏感染的宿主通常呈现的症状、更快恢复时间和/或感染的宿主中病毒效价降低来展(c)的连续渗滤的相应免疫原性组合物相比，所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于1logTCID50的述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4小时时，所述免疫原性组合物导致小于毒或活细菌与通过如本文所述及要求保护的方法制备的免疫原性组合物混合且孵育至少4[0171]可通过允许估计活病毒的量的标准体外滴定分析估计每毫升的TC免疫原性组合物优选在猪中诱导针对病原体(从该病原体衍生重组蛋白的氨基酸序列)的明的优选活病毒及优选活细菌分别是PRRS病毒(PRRSV)及猪肺炎支原体(Mycoplasma原性组合物进一步包含减毒的猪繁殖和呼吸综合征(P[0183]如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒病的至少一种其他病原体的病毒或细菌抗原。额外抗原可为国际专利申请WO2007/094893体”或在猪中引起疾病的至少一种其他病原体选自：胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumonia)(1)；腺病毒(2)；α病毒，例如东部马脑脊髓炎病毒(Easternequine短螺菌属(Brachyspiraspp.)(5)、优选猪痢疾短螺菌(B.hyodysentheriae)(6)；(Cl.difficile)(11)、A、B及C型产气荚膜梭菌(Cl.perfringens)(12)、诺维梭菌(Coronavirus)(16)、优选猪呼吸冠状病毒(PorcineRespi炎病毒(JapaneseEncephalitisVirus)(23)；细胞内散沫花属(Lawsoniaintracellularis)(24)；钩端螺旋体属(Leptospiraspp.)(25)，优选澳洲钩端螺旋体问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)(30)；波摩那钩端螺旋体(Leptospirapomona)(31)；塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospiratarassovi)(32)；分枝杆菌属(Mycobacteriumspp.)(33)优选鸟分枝杆菌(M.avium)(34)、细胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(35)及牛分枝杆菌(M.bovis)(36)；猪肺炎支原体(Mycoplasmahyopneumoniae)(37)；多杀巴斯德菌(Pasteurellamultocida)(38)；猪巨细胞病毒沙门菌属(Salmonellaspp.)(44)，优选S.thyhimurium(45)及猪霍乱沙门菌poxvirus)(53)；猪痘病毒(Swinepoxvirus)(54)；水疱性口炎病毒(Vesicular[0184]最优选地，如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本文所述及要求保护的试剂盒进一步包含一或多种减毒的或灭活的非PRRS[0185]在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本[0186]在另一方面中，本发明涉及如本文所述及要求保护的免疫原性组合物和/或如本皆被被病原体(免疫原性组合物中的(一种或多种)免疫原性活性成分衍生自所述病原体)清洁压缩空气及氧气(O2)控制溶解氧(D[0207]将由上述上游方法产生的3L样品送至实验室并基于体积浓缩至300mL以达到10倍[0210]通过超滤将产物浓缩至基于体积的原始抗原体积的10倍。当通过浓缩处理抗原[0211]利用HPLC量化方法，可以看出此方法已消除≥99％的任何残余昆虫细胞培养基设计使得灭活罐中含有抗原的溶液可以连续进料速率直接送至下游处理(DSP)罐，直至灭[0215]DSP罐是用于方法中抗原及最终抗原呈递的储存库。此罐的程序化重量控制整个从DSP罐进入MF单元的进料管线、反馈回DSP罐的渗余物管线及渗透物至废液的转移管线。这些桶储存于4±2℃直至疫苗掺和。[0220]然后将由上述上游及下游处理产生的产物最后与卡波姆溶液(佐剂)及生理盐水 (P盐水)混合。此研究性兽医产品在下文中也分别称为1号研究性兽医产品(IVP)或[0225]利用优化方案，设计一项研究，以研究在用实施例1的1号研究性兽医产品(IVP)[0227]评估包括两批IVP1(一种以高效力制备，且一种以常规/标准释放功效制备)及两[0230]对于每个IVP2批次，时间0时重构后的PRRS病毒效价是类似的，与冻干物用WPBS(洗涤磷酸盐缓冲盐水(＝磷酸盐缓冲盐水洗涤溶液))或用IVP1重构无关且与科学家无关。[0242]用每批亚单位疫苗(IVP1)以所有可能的组合测及时间间隔用无菌洗涤磷酸盐缓冲盐水(WP[0252]在补充有10％FBS及硫酸庆大霉素的MEM中制备AK_MA104细胞的细胞培养悬浮[0264]在倒置显微镜下读取板的最终细胞病变效应log10TCID50/1mL剂量。将每一测试间隔的每一样品的效价报告为两个连续有效测试时段[0267]在用WPBS稀释剂对照重构后在0(T0)、2(T2)及4(T4)小时获得的IVP2的病毒效价[0274]PRRS病毒效价表示为log10TCID50/1mL剂量。每一效价值表示在两个测试日获得MID且于室温孵育的四小时期间保持稳定。这些结果与已知的先前测定的IVP2产物特征一[0277]T0时用两批IVP1中的任一者测试的两批IVP2获得的结果显示与用各对照获得的[0278]在T2及T4时用两批IVP1中的任一者重构后两批IVP2获得的结果显示稳定的病毒[0283]本研究的目的是研究在于当与IVP1联合使用时，疫苗接种后3周时IVP2的免疫性[0285]与对照组的动物相比，用IVP1/IVP2接种疫苗的动物的中值肺病灶评分降低尽管PRRSV抗体阳性动物的数量在攻毒后一周在两组之间无统计学上显著的差异，但与对IVP2/IVP1疫苗接种，且30头(对照组)在3周龄(即，在研究第0天(D0))时接受无菌稀释剂[0292]在评价主要结果参数时，与对照组相比，用IVP2/IVP1疫苗接种显著减少淋巴消30头猪(76.7％)在至少一类淋巴病灶评估中具有中度至重度评分，而仅有2/30头猪[0296]本研究的目的是评估当与IVP2联合使用时IVP1的免疫性的持续时间。出于此目之后在D119(免疫性的17周持续时间)进行PCV2的毒低的PCV2病毒负荷，在任何取样点无被视为病毒血症以引起疾病的病毒水平((rt_PCR)测有功效的强力指标。大多数对照组(81％)直至D140(用PCV2攻毒后3周)才呈PCV2血清学阳[0301]本研究的目的是探究在与IVP1联合使用时，在疫苗接种后6个月时IVP2的免疫性疫苗接种后182天(免疫性的六个月持续时间)进行攻毒。此研究的主要参数是在攻毒后10洲药典描述灭活后抗原中不应保留BEI。欧洲药典允许灭活后残余硫代硫酸钠的检测对于确保抗原中不会保留毒性水平的BEI是可接受的。因此，由于最初在灭活步骤开始时添加[0309]来自此实验的数据指示，如实施例1中所述的方法意外地已经在10倍浓缩及渗滤[0328]称重1.2g硫代硫酸钠五水合物参考材料且转移至具有纯化水的1000mLA类容量[0330]将2mL硫代硫酸钠原液转移至50mLA类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且[0332]将1mL硫代硫酸钠原液转移至50mLA类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且[0334]将3mL硫代硫酸钠原液转移至50mLA类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且[0336]将1mL50％LS转移至20mLA类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒[0338]将500μL灭活的抗原流体转移至10mLA类容量烧瓶中。用稀释剂稀释至一定体积且通过倒置彻底混合。经由0.2μm尼龙注射过滤器将样品过滤至HPLC小瓶中，消耗前2至[0366]发现样品(i)(在BEI中和之后但在下游处理之前获取)仍然具有在毫摩尔范围内[0369]基于阴离子交换及尺寸排阻色谱分离的二维UPLC方法用于分析含有由如实施例1[0395]g梯度：以0.6mL/min的流速穿过阴离子交换柱驱[0412]发现与上游处理样品相比，如实施例1中所述的下游处理(即10倍浓缩及连续渗[0413]令人惊讶的是，发现如实施例1中所述的下游处理后获取的样品的峰比率(峰A/B由于聚集对浓度的依赖性，本领域技术人员将预计在尺寸排阻色谱(SEC)上观察到所述浓[0417]在昆虫细胞培养基及用过的培养基中应用常规方法定量游离氨基酸以测定如实[0419]测量在如实施例1中所述的下游处理(即，10倍浓缩及连续渗滤)质后获取的若干[0426]就此而言，最终产品(疫苗)中这些氨基酸的典型平均浓度也经测定在以下范围过参考这些附图中的一或多者结合本文所示具体实施方案的详细说明来更好地理解本发[0438]SEQIDNO:2对应于PCV2bORF2蛋白的序列；如本文所提及的[0440]1.一种制备包含重组蛋白的免疫原性组合物的方法，其中所述方法包含以下步[0444](b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物或使得处理溶液中经中和的灭活剂的浓度和/体的一部分由用至少一个过滤器过滤所述混合物组成或包含用至少一个过滤器过滤所述[0463]将所述混合物进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中所述至少一个[0464]排出包含所述经中和的灭活剂和/[0466]将所述溶液进料至包含至少一个过滤器的过滤器系统中，其中所述至少一个过[0467]排出包含所述经中和的灭活剂和/[0468]以等于渗透物流的速率向所述总体流添加第二液体，其中所述第二液体不同于和/或至少一个中空纤维过滤器，且其中所述至少一个平板过滤器优选是至少一个盒式过[0472]11.如项目6至10中任一项的方法述四级结构的平均孔径，和/或其中所述滤膜具有介于约200kDa与约500kDa之间的分子量[0474]和/或其中所述滤膜优选由聚醚砜组成或包含聚醚砜，或其中所述滤膜任选地是[0481]16.如项目1至15中任一项的方法，其中从步骤(a)产生的所述混合物的体积是形剂及其组合的又一组分混合，且其中从所述混合产生的溶液中所述重组蛋白的浓度和/或所述四级结构的浓度优选是大约从步骤(a)产生的所述混合物中所述重组蛋白和/或所[0488](1)允许用包含编码所述重组蛋白的核酸序列的载体感染培养物中的易感细胞，[0489](2)其后从所述细胞培养物中回收所述重组蛋白和/或包含多个所述重组蛋白的滤将细胞碎片与所述重组蛋白和/或所述四级结构分离，其中所述至少一个过滤器优选具[0493]23.如项目21或22的方法，100％序列相同性的序列，或优选由与SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2的序列具有至少[0498]28.如项目3至27中任一项的方法，[0500]30.如项目5至29中任一项的方法剂浓度小于从步骤(iii)产生的所述中和[0501]31.如项目1至30中任一项的方法，其骤(c)的连续渗滤的免疫原性组合物混合物相比，由所述方法产生的所述免疫原性组合物的杀病毒活性降低至少20和/或其中当活病毒与通过所述方法制备的所述免疫原性组[0503]33.如项目31或32的方法，其中所述活[0505]35.如项目34的免疫原性组合物，其中所[0506]36.如项目34的免疫原性组合物，其中所中任一项的方法获得，且其中从步骤(d)产生的所述免疫原性组合物基本上不含硫代硫酸[0508]_重组PCV2ORF2蛋白，其优选包[0510]且其中优选地，所述免疫原性组合物基本上不含经中和的灭活剂和/或基本上不可通过包含步骤(d)的任何所述方法获得，其中所述免疫原性组合物当于室温经受二维(2D)超高效液相色谱(UPLC)时展现峰A面积对峰B面积的比率为0.2_0.4和/[0541]_以0.6mL/min的流速穿过所述阴离子交换柱驱动0分钟时初始100％50mMTris[0543]色谱的第二维，其中以0.3mL过具有1.75mL柱体积与450A的孔径的尺寸排阻柱，[0548]44.如项目34至43中任一项的免疫原[0549]45.如项目34至44中任一项的免疫原性[0550]46.如项目34至45中任一项的免疫原原性组合物后，所述免疫原性组合物诱导针对[0551]47.如项目45或46中任一项的免疫[0555]51.如项目34至50中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至50中任一项的试[0556]52.如项目34至47及51中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至50中任一项[0557]53.如项目34至47及51至52中任一项的免疫原性组合物和/或如项目48至52中任其中所述非PRRSV病原体选自猪肺炎支原体、伪狂犬病病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、[0562]55.一种产生包含重组蛋白的免疫原[0565]重组PCV2ORF2蛋白和/或包含多个重组PCV2OR[0566](b)通过从步骤(a)产生的混合物去除所述第一液体的一部分来浓缩所述混合物