《动物药学》教案-项目5：生物制药技术

灵芝多糖发酵生产一、任务基本信息项目核心内容任务名称灵芝多糖发酵生产合作双方校方：生物医药学院企业：适用专业/岗位专业：生物制药技术岗位：发酵工程制药工参与人员校方：企业：任务目标一、知识目标1.掌握灵芝多糖液态深层发酵的基本原理与生产工艺特点。2.掌握培养基配制、灭菌原理及无菌操作的理论依据。3.理解液态深层发酵工艺参数（温度、pH、溶氧、搅拌转速、接种量、培养时间）对灵芝菌丝生长及多糖合成的影响机制。4.掌握灵芝发酵过程生长曲线变化规律，熟悉菌丝生长、代谢产物积累的动态变化特点及发酵异常现象的成因。5.掌握灵芝多糖提取、分离、纯化的基本原理，理解水提、醇沉、离心、过滤等纯化技术的理论基础。6.了解生物发酵车间GMP规范、发酵设备安全操作规程、实训过程质量控制与安全生产知识。二、技能目标1.熟练掌握无菌接种、超净台操作、菌种传代与保藏技能，杜绝杂菌污染。2.能够根据配方精准称量原料，独立完成发酵培养基配制、pH调节、分装与高压蒸汽灭菌操作，规范完成前期准备工作。3.能够熟练操作摇床、发酵罐等设备，完成灵芝液态深层发酵接种、培养全过程，能够根据生长状态调整培养参数。4.能够定时观察发酵状态，取样检测菌丝长势、发酵液性状，准确记录发酵数据，判断发酵终点、识别发酵污染、长势差等常见异常问题。5.熟练掌握发酵液预处理、离心、过滤、热水浸提、乙醇沉淀等操作，独立完成灵芝多糖粗品提取与纯化操作。6.能够按照6S与GMP要求完成设备清洗、场地整理、器具灭菌，具备发酵生产过程质量控制、安全操作和实训问题分析与处理能力三、素质目标1.

培养严谨细致的科学态度，严格遵循操作规范，重视发酵过程中的数据真实性与可追溯性，杜绝违规操作。2.

强化责任与安全意识，树立“质量第一”的理念，能识别发酵生产中的安全隐患（如灭菌不彻底、设备泄漏）并及时处理。3.

提升团队协作与问题解决能力，在多岗位配合中高效沟通，面对发酵异常时能冷静分析、协同制定解决方案，适应工业化生产需求。二、任务方案【任务说明】《灵芝多糖发酵生产》紧扣大健康产业新趋势，聚焦中医药现代化核心新赛道—中药发酵，立足新赛道技能型人才稀缺，以产教融合理念为指引，引入合作企业灵芝发酵真实项目，构建“生产场景+教学实践”一体化教学模式，精准对接生物制药技术、中药制药专业人才培养目标，实现生产与教学深度融合、协同育人。【仪器与设备】5L全自动小型发酵罐、30L机械搅拌式发酵罐【任务流程】序号操作步骤具体操作内容1菌种活化1.取保存于液体石蜡灵芝菌株，接种至斜面培养基（马铃薯葡萄糖培养基）；2.

30℃恒温培养3-5天，直至斜面长满绿色菌丝·接种过程需在无菌超净台操作，避免杂菌污染；·

活化后的菌种需镜检确认无杂菌，菌丝形态正常

。2摇瓶培养1.

配制摇瓶培养基（玉米浆20g/L、葡萄糖20g/L、乳糖10g/L、KH₂PO₄

1g/L），分装后121℃灭菌20min；2.

接入活化菌种，28℃、220r/min摇床培养2-3天；3.

培养基pH需调节至6.5-6.8；4.

培养结束后检测菌种浓度（OD600≥2.0），无杂菌生长。

3种子罐扩大培养

1.

1-3级种子罐依次扩大，培养基同摇瓶（按比例放大），121℃灭菌30min；2.

按10%-15%接种量转接，27℃培养，通气量1:0.8-1.0

vvm，搅拌速度200-300r/min；3.

培养24-36h后，镜检菌丝体形态（分支均匀），接入发酵罐

1.

每级种子罐接种前需确认无菌状态；4.

控制溶氧≥30%，避免缺氧抑制菌种生长

。4发酵培养基配制与灭菌1.

培养基配制与灭菌·配方：玉米浆30g/L、葡萄糖15g/L、乳糖25g/L、硫酸铵5g/L、CaCO₃

3g/L、MgSO₄

0.5g/L；·操作：将原料溶解后调节pH至6.5，转入发酵罐，关闭罐门后121℃、0.1MPa湿热灭菌30min，灭菌后降温至27℃。5发酵培养1.接种：种子液按10%-15%比例接入发酵罐，接种过程需无菌操作，避免罐内压力骤变；2.发酵参数控制：·温度：前3天25-27℃，后期降至23-25℃（延长产素期）；

·

pH：维持6.2-6.8，通过自动补加25%氨水调节；·溶氧：通气量1:1.0-1.2

vvm，搅拌速度300-400r/min，确保溶氧≥20%；·营养补加：发酵48h后，按速率补加葡萄糖（5g/L·d）、硫酸铵（1g/L·d），避免碳源/氮源过量抑制产素。3.

过程监测·取样频率：每4h取样1次；·检测项目：菌种浓度（OD600）、青霉素含量（高效液相色谱法）、pH、残糖量、杂菌情况；·发酵终点：残糖量≤1g/L时，终止发酵，发酵周期约6-8天。【数据记录与报告】序号考核项目内容操作记录工况确认1移种操作升罐压，确定种子罐罐压大于发酵罐罐压。罐压：2种子罐准备工作空气流量调节对过滤器进行通气操作，确认过滤系统完好。3过滤器蒸汽灭菌高效过滤器蒸汽灭菌，规定温度维持规定时间。温度：开始时间：结束时间：4灭菌后对过滤器进行吹干。开始时间：结束时间：5种子罐实消消毒灭菌消毒控制规定温度、压力维持规定时间。温度：压力：开始时间：结束时间：6接种操作接种操作接种时，操作控制罐压，罐压为：7发酵罐空罐准备流量调节对过滤器进行通气操作，确认过滤系统完好。过滤器蒸汽灭菌高效过滤器蒸汽灭菌，规定温度维持规定时间。开始时间:结束时间:完成灭菌后对过滤器进行吹干

开始时间:结束时间:空罐准备使用一次水对罐体进行全面清理

开始时间:结束时间:8发酵罐实消消毒灭菌消毒控制规定温度、压力维持规定时间。温度：压力：开始时间：结束时间：【考核评价】项目操作要求考核内容评分标准分值评分结果（一）交接班及设备检查(2.5分)种子罐交接检查（关键控制点）PI1301检查检查牌未旋转到“检查”状态，只要有一项漏检，扣0.8分0.8PI1304检查PI1307检查FI1301检查发酵罐A/B交接检查（关键控制点）PI1308检查检查牌未旋转到“检查”状态，只要有一项漏检，扣0.8分0.8PI1311检查PI1314检查FI1302检查物品检查检查工具及物品未检查接种工具、仪器设备等物品，扣0.2分0.2过程巡检种子罐检查种子罐未检查，检查后未将罐体、管线、阀件旋转到“检查”状态，扣0.2分0.2发酵罐漏点检查发酵罐漏点检查发酵罐A未检查，检查后未将罐体、管线、阀件旋转到“检查”状态，扣0.5分0.5(二)接种操作(8.5分)接种帽灭菌旋转接种帽种子罐实消过程中第一次未旋转接种帽(有动作，接种帽拧动即可），扣0.2分0.2种子罐实消过程中第二次未旋转接种帽，或未戴隔热手套，扣1分1取样正确标注未按照规范填写罐号/培养时间/取样时间的标签，扣0.4分0.4取样操作未按照规范用新洁尔灭进行消毒操作，扣0.5分0.5定量取样取样量不在（100mL±5mL）范围内，扣1分1接种环境灭菌接种前未正确使用新洁尔灭对周围环境灭菌（需按照接种口为中心0.5米范围内旋转喷洒操作)，扣0.2分0.2接种工未戴手套操作，扣0.5分0.5接种操作消毒工未按照要求进行接种操作（先在火圈内铺好棉花，再用95%酒精浸润脱脂棉），扣0.3分0.3消毒工未正确、及时佩戴隔热手套或未拧下接种帽，接种帽至于火焰附近5-10厘米处，扣0.5分0.5接种工未按顺序点火，在火焰附近5厘米范围内松绳、去掉牛皮纸、瓶塞，扣0.5分0.5未将用过的火柴、棉绳、牛皮纸置于防爆垃圾桶中，扣0.5分0.5接种工未在火焰周围2-5厘米内需要旋转、稳定快速拔出瓶塞，扣0.5分0.5接种工未在火焰保护下，准确，迅速的倒入种子，或接种瓶脱手，扣0.5分0.5未在火焰熄灭前完成接种操作，扣0.5分0.5接种从打开接种帽到开始拧接种帽，时间在1分钟内，超过1分钟，扣0.5分0.5接种完成后，消毒工未戴手套拿接种帽（帽口向火焰）在火焰上旋转一圈（约5秒），扣0.3分0.3消毒工未戴手套在5秒内拧上接种帽，扣0.3分0.3接种后处理接种后处理消毒工接种完成后未正确熄灭火焰，扣0.3分0.3(三)接种质量(3分)接种质量裁判现场评分实际接种量/100g=K。K＜0.97，得0分；0.97≤K≤0.98，得1分；K＞0.98，得2分；K≧0.99，得3分3(五)填写生产记录(2分)生产记录情况按照流程记录工段操作内，未按照流程记录正确的时间点，扣1分1记录内容正确生产记录内容不正确或有空项，扣0.5分0.5记录工整记录涂改，或记录不工整，扣0.5分0.5（六）安全文明生产（5分）个体防护按照行业有关安全规范，着工作服、手套未佩戴或佩戴不规范（头发露出工作帽、未系鞋带、工作服未系满扣、带饰品），扣1分1操作时未戴手套或操作过程中手套放置在操作区域，扣1分1安全行为选手在操作过程中要规范动作及行为脚踩管道、蹲坐、跑步或蹦跳上楼梯，上下楼梯每次跨一节楼梯，或出现摔倒现象，扣1分1环境卫生保持现场环境整齐、清洁、有序未按照HSE规范放置废物，或从柜中(或推车上）取放物品用后没有归位，扣1分1工具使用操作任何工具及物品是否规范操作工具及物品脱落掉地，或未放在指定位置，或身体各部位接触管道，扣1分1重大事故由于操作不当引起设备损坏及人身伤害事故考核期间出现由于操作不当引起的设备损坏，或人身伤害事故，扣5分（本项未倒扣分）★三、任务评分本任务考核采用校企双导师联合评分机制，双方依据不同考核重点分工评分，具体如下：企业导师：聚焦学生实操能力，重点评估实验过程中的操作规范性、数据准确性及问题解决能力，评分占比60%。校内导师：聚焦学生理论与成果梳理能力，重点评估实验报告完整性及理论掌握程度，评分占比40%。四、任务保障1.技术与资源保障：企业提供符合行业标准的阿莫西林片样品、检测仪器与试剂；校方提供实验理论指导，协助解决技术难题。2.安全保障：校企共同开展实验室安全培训，学生签订《实验安全承诺书》；实验现场配备急救箱与防护用品（如护目镜、手套），明确应急联系人（企业安全员+校方指导老师）。3.沟通保障：定期召开线上例会，企业导师反馈问题，校方及时调整教学计划。

α-干扰素分离纯化一、项目基础信息模块核心内容项目名称α-干扰素的分离纯化合作双方校方：生物医药学院企业：江苏悦世医药科技有限公司参与人员校方：张力、周末、圣志存、卢会鹏、冯艺企业：汤晓雷（总经理）、项斌（工艺研发项目组组长）项目目标学生：掌握蛋白质分离纯化的基本流程，能够完成α-干扰素粗提液或教学模拟蛋白样品的预处理、离子交换色谱分离、超滤浓缩和蛋白检测分析；熟悉蛋白纯化系统、超滤装置、紫外分光光度计和SDS电泳系统等仪器的基本操作；能够记录关键工艺参数，并根据蛋白浓度、纯度和回收率判断纯化效果。校方：将企业蛋白类生物制品分离纯化的实际流程转化为适合高职学生完成的生产性实训项目，完善《生化分离技术》课程实训案例库，提升学生对生物制药分离纯化岗位的适应能力。企业：提供α-干扰素分离纯化相关生产案例和技术指导，参与实训项目内容设计、操作规范制定和学生实操评价，为企业储备具备基础蛋白纯化技能的技术人才。二、项目方案【项目说明】α-干扰素是一类具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的生物活性蛋白。企业生产中，其下游分离纯化主要包括样品处理、层析分离、膜分离浓缩和质量检测等环节。本项目依托江苏悦世医药科技有限公司相关生产流程，以α-干扰素粗提液或教学模拟蛋白样品为对象，开展“样品预处理—离子交换色谱分离—超滤浓缩—蛋白检测”实训，使学生掌握蛋白分离纯化的基本方法和关键操作。【仪器与试剂】仪器：蛋白纯化系统或层析柱架、紫外检测器、超滤装置或超滤离心管、冷冻离心机、紫外分光光度计、pH计、电导率仪、电子天平、冰箱、SDS电泳系统、凝胶成像系统、移液枪、离心管、样品收集管、层析柱、废液缸。试剂：α-干扰素粗提液或教学模拟蛋白样品、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液、氯化钠、超纯水、蛋白定量试剂、SDS凝胶制备试剂、蛋白Marker、考马斯亮蓝染色液、脱色液、75%医用酒精。冷冻离心机、超声破碎仪、超净工作台、蛋白纯化系统或层析柱架、紫外检测器、紫外分光光度计、pH计、电导率仪、磁力搅拌器、电子天平、冰箱、超滤装置或超滤离心管、SDS电泳系统、凝胶成像系统、移液枪、离心管、层析柱、样品收集管、废液缸。【操作流程】序号操作步骤具体操作内容1实验准备与样品登记（1）检查蛋白纯化系统、紫外检测器、超滤装置、冷冻离心机、紫外分光光度计和SDS电泳系统是否正常；（2）准备离心管、收集管、枪头、层析柱、超滤膜、标签纸和记录表；（3）按要求配制平衡缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液，记录pH、电导率和配制日期；（4）领取α-干扰素粗提液或教学模拟蛋白样品，记录样品名称、编号、体积、外观和操作者。2样品预处理（1）将样品置于冰上或4℃条件下暂存，观察样品是否澄清、有无沉淀或絮状物；（2）必要时进行低温离心或过滤，去除不溶性杂质，获得澄清样品；（3）记录预处理方式、处理前后体积、样品外观、pH和初始蛋白浓度。3离子交换色谱分离（1）用平衡缓冲液充分平衡离子交换柱；（2）将预处理后的样品缓慢上样，控制流速和柱压；（3）上样结束后，用洗涤缓冲液去除未结合杂蛋白；（4）采用氯化钠梯度洗脱或阶梯洗脱方式洗脱目标蛋白；（5）根据A280紫外吸收峰收集洗脱组分，并记录目标峰编号、收集管号、洗脱体积和蛋白浓度。4超滤浓缩与换液（1）合并含目标蛋白的洗脱组分，根据α-干扰素分子量选择合适截留分子量的超滤膜；（2）将样品加入超滤装置进行浓缩，控制离心条件或操作压力，避免过度浓缩造成蛋白沉淀；（3）根据需要进行缓冲液置换；（4）记录超滤前体积、超滤后体积、浓缩倍数、最终样品外观和蛋白浓度。5蛋白检测与结果分析（1）采用紫外吸收法、BCA法或Bradford法测定样品蛋白浓度；（2）取粗提液、预处理后样品、离子交换洗脱峰和最终浓缩样品进行SDS分析；（3）观察目标蛋白条带是否清晰，比较杂蛋白条带变化；（4）计算最终总蛋白量、回收率和纯化倍数，判断纯化效果。6样品保存与清场（1）将最终α-干扰素样品分装，标注样品名称、编号、浓度、体积、日期和操作者；（2）样品按要求置于4℃、-20℃或-80℃保存；（3）清洗层析柱、管路、超滤装置和操作台面；（4）分类处理含蛋白废液、染色废液和一次性耗材；（5）填写实验记录、仪器使用记录和清场记录。【数据记录与报告】样品名称α-干扰素粗提液/教学模拟蛋白样品样品编号IFN-α-______样品来源□企业提供□校内模拟制备□教师统一配制样品初始情况体积：______ml；外观：□澄清□浑浊□有沉淀；初始蛋白浓度：______mg/ml样品预处理方式：□低温离心□过滤□直接上样；处理后体积：______ml；状态：□澄清□轻微浑浊离子交换色谱色谱柱/填料：______；上样体积：______ml；流速：______ml/min；洗脱方式：□NaCl梯度洗脱□NaCl阶梯洗脱目标峰收集目标峰编号：Peak______；收集管号：至；目标峰体积：______ml；蛋白浓度：______mg/ml超滤浓缩超滤膜截留分子量：______kDa；超滤前体积：______ml；超滤后体积：______ml；浓缩倍数：______倍最终样品最终体积：______ml；最终蛋白浓度：______mg/ml；样品状态：□澄清□轻微浑浊□有沉淀检测方法□紫外吸收法□BCA法□Bradford法□SDSSDS结果目标条带：□清晰□较清晰□较弱□未见明显条带；杂蛋白条带：□少□较多结果计算最终总蛋白量：______mg；回收率：______%；纯化倍数：______倍；纯度估算：______%标准规定记录完整、数据真实；最终样品无明显沉淀；目标条带清晰或较清晰；教学考核中蛋白回收率建议≥70%，纯度建议≥85%。该指标与申报材料中“蛋白回收率70%、纯度85%”的预期要求保持一致。异常情况□无□有，说明：______结果分析综合结论□符合实训要求□基本符合实训要求□不符合实训要求检验者：校对者：审核者：【考核评价】考核项目考核要点评分标准评价主体分值得分职业素养实验室安全意识、无菌与规范操作意识、团队协作能力未按要求穿戴防护用品扣3分；样品未按要求低温保存扣3分；团队协作不积极扣2分；实验态度不认真扣2分。企业导师校内导师10操作规范仪器检查、缓冲液配制、样品登记、耗材准备仪器未检查或异常未报告扣4分；缓冲液配制错误扣4分；样品信息登记不完整扣3分；耗材准备不齐全扣2分。企业导师12样品观察、低温离心或过滤、澄清样品收集未观察并记录样品状态扣3分；离心或过滤操作不规范扣4分；收集样品时混入沉淀扣4分；处理前后体积记录不完整扣2分。企业导师12色谱柱平衡、样品上样、洗涤洗脱、目标峰收集色谱柱平衡不充分扣5分；上样操作不规范扣5分；流速控制不当扣4分；洗脱条件设置错误扣4分；目标峰收集不准确扣5分；层析记录不完整扣2分。企业导师22超滤膜选择、浓缩过程控制、样品回收超滤膜规格选择不当扣3分；浓缩过程控制不当扣4分；样品回收不完全扣3分；超滤前后体积记录错误扣2分。企业导师10蛋白浓度测定、SDS结果判断、回收率和纯度分析蛋白浓度测定不规范扣3分；SDS操作或结果判断错误扣4分；回收率或纯化倍数计算错误扣4分；结果分析不清楚扣2分。企业导师14原始记录、样品标识、废液处理、仪器清洁原始记录缺失或不规范，每项扣1分；样品标识不完整扣2分；废液分类错误扣2分；未清洗仪器或台面扣2分。企业导师10结果判定实测结果描述、标准对照、结论判定未准确描述最终样品状态、目标条带、纯度或回收率等实测结果扣3分；未能结合标准要求进行判断扣3分；结论判定错误扣4分。校内导师企业导师10三、项目评分本实验考核采用校企双导师联合评分机制，双方依据不同考核重点分工评分，具体如下：企业导师：聚焦学生实操能力，重点评估实验过程中的操作规范性、数据准确性及问题解决能力，评分占比60%。校内导师：聚焦学生理论与成果梳理能力，重点评估实验报告完整性及理论掌握程度，评分占比40%。四、项目保障1.技术与资源保障：校方依托生物制药实训中心开展项目实施，提供蛋白纯化系统、超滤装置、紫外分光光度计、SDS电泳系统、离心机、pH计、电导率仪等实训设备，并准备缓冲液、层析柱、超滤膜、蛋白定量试剂、电泳试剂等实验耗材。江苏悦世医药科技有限公司提供α-干扰素分离纯化相关生产案例、技术指导和操作规范建议，协助校方将企业蛋白纯化流程转化为适合教学实施的实训项目。2.安全保障：项目实施前由校内导师和企业导师共同开展安全培训，重点讲解蛋白样品低温保存、层析系统压力控制、超滤装置使用、电泳操作安全、染色废液处理和生物样品废弃物处置。实训过程中要求学生穿戴实验服、手套、口罩等防护用品，严格按照仪器操作规程进行实验。若出现样品泄漏、柱压异常、仪器故障、电泳设备异常等情况，应立即停止操作并报告指导教师，待问题排除后方可继续实验。3.沟通保障：项目实施前召开校企沟通会，明确实训目标、操作流程、岗位要求、考核标准和师生分工。实训过程中建立校企沟通机制，由企业导师对关键操作环节提供指导，校内导师负责课堂组织、过程记录和问题反馈。项目结束后，校企双方根据学生实训表现、实验数据、考核结果和报告质量进行复盘，及时优化操作流程、数据记录表和评分标准，保证项目持续改进。

鸡胚成纤维细胞分离培养与活性鉴定——动物原代细胞制备实训一、项目基础信息模块核心内容项目名称江苏勃林格殷格翰生物制品有限公司禽用活疫苗生产用鸡胚成纤维细胞（CEF）分离制备实训项目合作双方校方：生物医药学院（生物制药技术专业）企业：江苏勃林格殷格翰生物制品有限公司参与人员校方：周末、张继玲、圣至存企业：研发部技术代表2人（原代细胞制备专员）项目目标学生：掌握动物原代细胞（鸡胚成纤维细胞）分离制备的核心技术流程；熟练进行无菌取材、组织消化、细胞分离与纯化操作；掌握台盼蓝染色法进行细胞活性鉴定的方法；理解原代细胞与传代细胞株的区别及其在禽用疫苗生产中的应用价值。校方：将企业原代细胞制备的真实岗位需求融入实训教学，完善生物制药专业动物细胞培养实训案例库；提升学生岗位适配能力与生物安全操作规范意识。企业：验证实训培养学生的原代细胞制备实操能力是否符合岗位要求；储备鸡胚成纤维细胞等原代细胞制备技术人才；探索校企联合培养订单班模式。二、项目方案【项目说明】选取9-11日龄SPF鸡胚，摘取胚体组织（去除头部、四肢及内脏），经眼科剪充分剪碎后，用0.25%胰蛋白酶消化液于37℃条件下消化，使细胞间连接及细胞外基质解离，释放出单个细胞；经无菌筛网/纱布过滤去除未消化组织块，离心收集细胞后重悬于含血清培养基，通过台盼蓝染色法鉴定细胞活性（活细胞膜完整不着色，死细胞膜通透性增加而着色），计数合格后按一定密度接种培养瓶，于37℃、5%CO₂条件下培养，形成贴壁生长的鸡胚成纤维细胞（CEF）单层，可作为新城疫、传染性支气管炎、禽痘等禽用活疫苗生产的病毒增殖基质。核心原理：胰蛋白酶特异性分解细胞间连接蛋白及细胞外基质胶原纤维，使组织解离为单细胞悬液；血清中的抗胰蛋白酶成分终止消化反应；差速贴壁及台盼蓝拒染法保障所获细胞的种类纯度与活性质量。【仪器与试剂】仪器：生物安全柜、CO₂培养箱（37℃、5%CO₂）、倒置显微镜、离心机（室温）、血球计数板、恒温水浴锅（37℃）、解剖器械（眼科剪、眼科镊、大剪刀）、无菌培养皿（90mm）、无菌培养瓶（T25/T75）、100-200目无菌细胞筛网（或双层无菌纱布）、离心管（15/50mL）、移液枪（100μL/1mL/5mL）、酒精灯、酒精喷壶、碘伏棉球、废液缸。试剂：SPF鸡胚（9-11日龄，企业提供）、D-Hanks平衡盐溶液（无钙镁）、0.25%胰蛋白酶消化液、DMEM/M199培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素双抗溶液（100×）、0.4%台盼蓝染液、PBS缓冲液、75%医用酒精、碘伏。【操作流程】序号操作步骤具体操作内容1实验准备1.提前30min开启生物安全柜、CO₂培养箱、恒温水浴锅预热（37℃）；2.检查SPF鸡胚外观（蛋壳完整、无破损，照蛋透光正常），核对胚龄（9-11日龄）；3.用酒精喷壶消毒生物安全柜台面及仪器表面，点燃酒精灯，摆放解剖器械、无菌培养皿等耗材。2鸡胚取材与预处理1.用碘伏棉球消毒鸡蛋气室端蛋壳，75%酒精脱碘；2.无菌操作下敲开气室端蛋壳，用无菌镊子小心取出鸡胚，置于无菌培养皿中；3.剪除鸡胚头部、四肢及内脏（心、肝、肠等），保留躯干组织；4.用D-Hanks液反复漂洗胚体组织2-3次，去除残留血液。3组织剪碎与消化1.用眼科剪将胚体组织充分剪碎至1mm³以下小块；2.将剪碎组织转入无菌离心管，加入适量0.25%胰蛋白酶消化液（覆盖组织即可）；3.置37℃水浴消化8-15min，期间每隔3-5min轻轻振荡混匀，观察消化液变浑浊、组织块变松散。4细胞分离与过滤1.加入等体积含10%FBS的培养基终止消化；2.用无菌吸管反复轻柔吹打，使细胞充分分散；3.将细胞悬液经100-200目无菌筛网（或双层无菌纱布）过滤于新离心管中，去除未消化的结缔组织及血管碎块。5离心纯化与计数1.将滤液以1000rpm离心5-8min，弃上清；2.加入3-5ml新鲜培养基重悬细胞沉淀；3.取10μl细胞悬液与10μl0.4%台盼蓝染液混合，滴加至血球计数板，显微镜下区分活细胞（不着色）与死细胞（蓝染），计算细胞总数与活细胞率（需≥90%）。6接种培养与观察1.根据计数结果，按1×10⁶-2×10⁶个/ml密度将细胞悬液接种至培养瓶（T25瓶加5ml，T75瓶加15ml）；2.置37℃、5%CO₂培养箱培养，标注细胞名称（CEF原代）、制备日期、代次（P0）；3.传代后24h、48h分别通过倒置显微镜观察细胞贴壁及生长状态，记录汇合度与形态，判断是否符合后续病毒接种或传代要求。【数据记录与报告】样品名称（细胞类型）：来源（鸡胚日龄）：检查项目检验依据《兽用生物制品生产用细胞质量检验规程》、《中国兽药典》相关附录、企业细胞制备SOP仪器型号生物安全柜：______CO₂培养箱：______离心机：______显微镜：______鸡胚/原代组织状态鸡胚外观：□正常□异常（描述：）胚体组织重量：______g操作关键数据胰蛋白酶用量：______ml消化时间：______min离心条件：______rpm×______min接种密度：______个/ml细胞计数结果总细胞数：______活细胞数：______活细胞率：______%接种后细胞状态（24h/48h）24h：贴壁率______%形态：______48h：汇合度______%生长状态：□