2026年尿素分解菌实验指导与测试题(附答案)

2026年尿素分解菌实验指导与测试题(附答案)一、实验原理尿素分解菌是一类能分泌脲酶（EC3.5.1.5）的微生物，其核心代谢特征为通过脲酶催化尿素水解提供氨（NH₃）和二氧化碳（CO₂），反应式为：CO(NH₂)₂+H₂O→2NH₃+CO₂。氨的释放会导致环境pH升高，利用酚红（PhenolRed）作为pH指示剂（变色范围pH6.8-8.4，酸性条件下呈黄色，碱性条件下呈红色），可通过培养基颜色变化初步判断菌株是否具有尿素分解能力。进一步通过定量检测脲酶活性（如靛酚蓝比色法测定氨提供量）或分子生物学方法（如扩增脲酶编码基因ureC）验证其功能。二、实验材料与试剂1.实验材料环境样品：土壤（取自农田、堆肥或动物排泄物污染区域）、活性污泥（污水处理厂好氧池）或动物肠道内容物（需无菌采集）。标准菌株：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis，非尿素分解菌，阴性对照）、巴氏葡萄球菌（Staphylococcuspasteuri，已知尿素分解菌，阳性对照）。2.培养基与试剂尿素固体培养基（1L）：NaCl5g，KH₂PO₄2g，MgSO₄·7H₂O0.2g，葡萄糖1g，琼脂15g，蒸馏水定容至950mL（121℃高压灭菌20min）；灭菌后冷却至50℃，加入过滤除菌的10%尿素溶液50mL（终浓度1%），酚红指示剂（0.2%水溶液）1mL（终浓度0.002%），混匀后倒平板。LB液体培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，蒸馏水定容，121℃灭菌20min。无菌生理盐水（0.85%NaCl溶液）：121℃灭菌20min。脲酶活性检测试剂：缓冲液A：0.1mol/LTris-HCl（pH8.0），含10mmol/LEDTA、5mmol/LDTT（二硫苏糖醇）。底物溶液：100mmol/L尿素（用缓冲液A配制，0.22μm滤膜过滤除菌）。显色剂：苯酚-次氯酸钠溶液（苯酚5g溶于100mL无水乙醇，次氯酸钠溶液含有效氯≥5%，使用前按1:1体积比混合）；亚硝基铁氰化钠溶液（0.5g溶于100mL蒸馏水）。3.仪器与耗材超净工作台、恒温培养箱（30-37℃）、高压蒸汽灭菌锅、离心机（12000rpm）、紫外可见分光光度计（波长630nm）、涡旋振荡器、移液器（10-1000μL）、无菌试管、培养皿（φ90mm）、1mL无菌移液管、0.22μm滤膜及注射器、PCR仪（用于分子鉴定）、电泳仪及凝胶成像系统。三、实验操作步骤（一）样品预处理与梯度稀释1.称取环境样品10g（土壤需过2mm筛去除杂质），加入90mL无菌生理盐水，置于250mL三角瓶中，30℃、200rpm振荡30min，使微生物充分分散。2.静置5min，取上清液进行梯度稀释：用1mL无菌移液管吸取1mL上清液至9mL无菌生理盐水中，混匀得10⁻¹稀释液；重复操作，依次制备10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵稀释度的菌悬液。（二）分离与初步筛选1.取10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵三个稀释度的菌悬液，各取0.1mL分别涂布于尿素固体培养基平板（每个梯度3个重复）。2.倒置平板，37℃培养24-48h，观察菌落周围培养基颜色变化：若菌落周围出现红色晕圈（pH升高导致酚红变色），则初步判定为尿素分解菌候选菌株，标记为“+”；无变色者标记为“-”。3.挑取红色晕圈明显的单菌落，在LB固体培养基上进行3次划线纯化，直至获得纯培养物（镜检确认无杂菌）。（三）复筛：定量测定脲酶活性1.制备菌悬液：取纯化后的菌株接种于LB液体培养基，37℃、200rpm培养至对数期（OD₆₀₀≈0.8），4℃、8000rpm离心10min收集菌体，用缓冲液A洗涤2次，重悬至OD₆₀₀=1.0（约1×10⁸CFU/mL）。2.酶促反应：取2mL菌悬液加入2mL底物溶液（终浓度50mmol/L尿素），37℃水浴反应30min；同时设置空白对照（菌悬液替换为缓冲液A）和灭活对照（菌悬液100℃煮沸10min后加入底物）。3.显色与比色：反应结束后，立即加入0.5mL显色剂和0.1mL亚硝基铁氰化钠溶液，混匀后37℃避光反应20min（提供蓝色靛酚），于630nm处测定吸光度（A₆₃₀）。4.计算脲酶活性：以硫酸铵（NH₄⁺）标准溶液（0-200μmol/L）绘制标准曲线，根据A₆₃₀值计算反应体系中NH₃的提供量。酶活性定义为：每毫升菌悬液每分钟催化提供的NH₃微摩尔数（μmol/(mL·min)）。（四）分子鉴定（可选）1.基因组DNA提取：采用CTAB法提取纯化菌株的基因组DNA（具体步骤：取1mL菌液离心收集菌体，加入500μLCTAB裂解液，65℃水浴30min；加入等体积苯酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），12000rpm离心10min，取上清；重复抽提至界面无蛋白层，加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA，70%乙醇洗涤，TE缓冲液溶解）。2.PCR扩增ureC基因：使用引物对UreC-F（5’-GACGGTGGTGATGATGTTCT-3’）和UreC-R（5’-CCAGTTGCCGTTGTTCTTCT-3’），反应体系（25μL）：2×TaqMasterMix12.5μL，引物各1μL（10μmol/L），DNA模板1μL，ddH₂O9.5μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃终延伸10min。3.电泳检测与测序：PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（120V，30min），凝胶成像系统观察是否出现约500bp的特异性条带（ureC基因片段）。阳性产物送测序，将序列提交至NCBIBLAST数据库比对，确认菌株分类地位。四、注意事项1.尿素溶液需过滤除菌（0.22μm滤膜），不可高压灭菌（高温会导致尿素分解为氨和CO₂，影响培养基pH）。2.梯度稀释时需严格无菌操作，移液管不可接触试管口或桌面，避免交叉污染。3.脲酶活性测定时，显色反应需避光进行，且各管反应时间需一致（误差≤1min），否则影响吸光度准确性。4.分子鉴定中，CTAB裂解液需现用现配，避免因EDTA沉淀影响DNA提取效率；苯酚-氯仿抽提时需戴手套操作，避免接触皮肤。五、测试题（附答案）一、选择题（每题2分，共20分）1.尿素分解菌的特征代谢产物是（）。A.乳酸B.氨C.乙醇D.乙酸2.尿素固体培养基中加入酚红的目的是（）。A.提供碳源B.抑制杂菌生长C.指示pH变化D.提供氮源3.以下哪种方法可用于定量检测脲酶活性？（）A.观察培养基变色B.16SrRNA测序C.靛酚蓝比色法D.革兰氏染色4.尿素溶液灭菌应采用（）。A.高压蒸汽灭菌（121℃）B.干热灭菌（160℃）C.过滤除菌（0.22μm）D.紫外线照射5.分离尿素分解菌时，培养基中尿素的主要作用是（）。A.唯一碳源B.唯一氮源C.缓冲剂D.生长因子6.梯度稀释时，10⁻⁴稀释液表示原样品被稀释了（）倍。A.10B.100C.1000D.100007.脲酶的编码基因是（）。A.16SrRNAB.ureCC.gyrBD.ITS8.以下哪种菌可作为尿素分解菌的阳性对照？（）A.大肠杆菌B.巴氏葡萄球菌C.金黄色葡萄球菌D.酿酒酵母9.显色反应中，亚硝基铁氰化钠的作用是（）。A.加速反应B.稳定蓝色产物C.调节pHD.抑制酶活性10.纯化菌株时，划线法的关键操作是（）。A.多次灼烧接种环B.始终使用同一区域划线C.菌液浓度越高越好D.平板倒置培养二、填空题（每空2分，共20分）1.尿素分解菌通过分泌______催化尿素水解，产物为______和二氧化碳。2.尿素固体培养基属于______培养基（填“选择”或“鉴别”），其pH指示剂为______。3.梯度稀释的目的是______，便于获得单菌落。4.脲酶活性测定时，空白对照应使用______代替菌悬液。5.PCR扩增ureC基因时，退火温度需根据______确定，一般为引物Tm值±5℃。6.土壤样品预处理时，振荡的目的是______。三、简答题（每题10分，共30分）1.为什么尿素不能高压灭菌？若错误高压灭菌，对实验结果有何影响？2.简述通过靛酚蓝比色法测定脲酶活性的原理。3.如何判断分离得到的菌株是纯培养物？需进行哪些验证？四、综合题（30分）某实验室从土壤中分离到一株能使尿素培养基变红的菌株，但脲酶活性测定结果显示其酶活性极低（接近空白对照）。请分析可能的原因，并设计实验验证你的假设（要求写出实验步骤、预期结果及结论）。答案一、选择题1.B2.C3.C4.C5.B6.D7.B8.B9.B10.A二、填空题1.脲酶；氨（NH₃）2.鉴别；酚红3.降低菌液浓度4.缓冲液A5.引物Tm值6.使微生物充分分散三、简答题1.尿素在高温（121℃）下会分解为氨和二氧化碳，导致培养基pH提前升高，酚红显色，干扰对目标菌株尿素分解能力的判断。若错误高压灭菌，未接种的空白平板可能提前变红，无法区分是菌株分解尿素还是尿素自身分解导致的颜色变化。2.脲酶催化尿素水解提供氨，氨与苯酚、次氯酸钠在亚硝基铁氰化钠催化下反应提供蓝色靛酚，蓝色深浅与氨浓度成正比。通过测定630nm处吸光度，与标准曲线比对，可定量计算氨提供量，进而确定脲酶活性。3.判断纯培养物需通过形态学观察（显微镜下菌体形态一致，无其他形状微生物）和分离培养验证（在LB平板上划线后仅出现单一形态菌落，重复3次以上无杂菌）。四、综合题可能原因：①菌株为杂菌，虽能利用其他碳氮源代谢产碱（如分解蛋白胨产氨），但不分泌脲酶；②菌株分泌的脲酶被培养基中的抑制剂（如重金属离子）抑制；③培养条件（如温度、pH）不适，导致脲酶未表达或活性低下。验证实验设计：步骤1：将该菌株接种于无尿素的LB固体培养基（含酚红），37℃培养24h，观察是否变红。步骤2：将该菌株接种于尿素固体培养基（添加EDTA螯合重金属，终浓度1mmol/L），37℃培养24h，