蛋白质纯化手册-GE-Healthcare-中文版-

fromGEGSTGeneFusionPrinciplesandMethodsAntibodyMethodologyandApplicationsIonExchangeChromatography&ChromatofocusingPrinciplesandMethodsChallengingProteinsPrinciplesandMethods

GelFiltrationPrinciplesandMethodsPurificationHandbookPrinciplesandMethods18-1142-HydrophobicInteractionandReversedPhaseChromatographyPrinciplesandMethods11-0012-2-DPrinciplesandMethodsMicrocarrierCellPrinciplesandMethods目前 概 名词和缩 符 膜蛋白 前 膜蛋白质的分 用于结构和功能研究的内膜蛋白质的纯 原材 表达和筛 前 新兴的工作流 串联亲和层析纯化 包涵 附录1不同纯化技术的原理和标准条 附录2手动以及自动纯 附录3装柱以及制 附录4数据换算：蛋白质、柱 流速 附录6氨基酸 订购信 本手册详细描述了内膜蛋白质、蛋白质复合物的分离纯化以及包涵体蛋白质的重新折叠的原理及方法。主要阅读人群为对上述领域感兴趣的学生及专业人士。为上述三类蛋白质分离纯化过程中可能出现的难题提供了有效的工具、策略和解决方案。关于普通蛋白质和重组蛋白质分离纯化技术的介绍，我们已经在《重组蛋白质纯化手册》及本系列丛书的其它手册中给出了详细说明。（见100页的相关文献）过去二十年，我们对可溶性蛋白质的结构及功能生物学的认识有了显著的提高。目前常规纯化策略对于可溶性蛋白的分析、纯化和制备均具有较高的成功率。然而在本手册描述的领域（内膜蛋白质、蛋白质复合物以及包涵体蛋白质）中情形却大不相同，目前对于这些棘手的蛋白质的操作和研究的需求是非常迫切的，这是因为：细胞内约30％的蛋白质为膜蛋白质，而目前市场上超过50％的药物是通过膜蛋白质发挥作用的。很多情况下，蛋白质需要通过同其它蛋白质的相互作用形成多蛋白复合物来执行它们的酶学、结构、转运及调节功能。许多在大肠杆菌中过量表达的可溶性蛋白质以错误折叠和不可溶的形式存在包涵体中本手册在每一章节会首先对相关领域的背景进行介绍，然后阐明并总结在该领域中有效的工作方法。除了描述大量不同蛋白质的实战纯化策略之外，各章还对相关领域提供了常规的建议和策略。常规的策略一般会作为建立和发展特定分离纯化策略的起点。一般来说，每个特定的蛋白质都会有自身独特的分离纯化策略，因此常规的分离纯化策略在应用于特定蛋白质时，其细节会因每个蛋白质的特点而发生改变。不仅如此，对于特定蛋白质的分离纯化，通常我们还不能有效预测对常规策略的改变。除非对常规策略的改变恰好适用，否则还是会一筹莫展。毕竟，这些类蛋白质的分离纯化对于相应的研究人员来说是一个极大的挑战。为了陈述这一问题，本文给出了基于关键参数的常规分离纯化策略，以及这些参数的可变范围。本手册还提供了使用其它策略的导引、线索及要点。280DNA脱盐（冲液等电点（SDS-SDS谷胱甘肽－S－单位（如酶的活性单位该符号表示对促进实验进程的常规建议或者在特定条件下推荐的操作。 该符号表示对疑难杂症分析和解决的建议膜蛋白质在基础生理过程（如分子转运、信号转导、能量利用以及细胞和组织结构的维护）具有及其重要的作用。基因组序列中大约有30％的基因编码的是膜蛋白质，其中50％是目前已知药物的靶点。然而目前我们对膜蛋白质的结构和功能在分子水平上的了解还远不及可溶性蛋白质。例如，在本手册出版前，PDB数据库（http://www/pd.og/）中膜蛋白质的三维结构数量仅仅占所有结构的1％。天然内膜蛋白质存在于生物膜的脂类环境中，但是目前研究内膜蛋白质的技术是首先把它们分散在水溶液的环境中，参照水溶性蛋白质的方法进行操作。为了有效的研究内膜蛋白质，将其溶解于水环境是必要的前提。目前通常是通过加入去污剂使得内膜蛋白质和脂类在水中形成可溶性的复合物来完成的。（Fig1.1）。内膜蛋白质的溶解是一个粗暴的处理过程，在此过程中经常会发生蛋白质变性和/或聚集。为了避免蛋白质的损失和失活，该过程优化时需要非常小心。因此溶解过程是处理膜蛋白质的最关键的步骤。除上述原因外，造成我们对膜蛋白质的结构和功能仍然缺乏详细认识的困难还包括低丰度：膜蛋白质在天然生物体中的数量是非常低的。因此一般的天然生物体不太适合作为制备膜蛋白质的原材料。难以制备：由于表达的目标蛋白质缺乏足够的插膜及折叠过程，或者缺少翻译后修饰，异原过表达的膜蛋白质经常表达量较低或者无活性。此外，过表达的膜蛋白对细胞还有毒害作用。因此，对膜蛋白质的表达、纯化和分析遇到了极大的挑战。出人意料的是，迄今为止大量的膜蛋白质，尤其是细菌来源的膜蛋白质，已经被成功的过表达、分离纯化并在分子水平上加以鉴定。而且，科学家们对几个来源于不同组织的膜蛋白质组的鉴定工作也已经完成。目前世界上有许多膜蛋白质实验室正在辛勤的劳动，对膜蛋白质进行遗传操作也已经开始出现。这些策略对于进行膜蛋白质研究是非常有用的。本章主要为读者提供了膜。transferredfromthenaturallipidbilayer(blueandyellow)tocomplexeswithdetergent(green)and,insomecases,lipids.Alipid-detergentmicelle,adetergentmicelle,andfreedetergentarealsoshown.膜蛋白质可以分为膜周蛋白质和内膜蛋白质。膜周蛋白质松散地同细胞膜相互作用，当它们从生物膜上解离出来后通常是能够溶于水的。对膜周蛋白质的操作通常要比对内膜蛋白质的操作相对容易一些。除非特殊标明，本手册内所说的“膜蛋白质”指的是内膜蛋白质。内膜蛋白质在水溶液中是不溶的。它们一般由一个或多个跨膜片段构成。其中跨膜的成分由单链的及成簇的α螺旋或β折叠结构组成，相应的膜蛋白质则被称为α螺旋膜蛋白质（Fig1.2,左）或β折叠膜蛋白质（ig12右）。β折叠膜蛋白质在革兰氏阴性菌及线粒体的外膜中含量较多。rhodopsin;PDBID:1XIO;[1])andaβ-barrelmembraneprotein(right;ferrichydroxamateuptakereceptor(fhua)fromE.coli;PDBID:1FCP;[2]).Thestructuresareorientedsuchthattheexternallyexposedareaofeachproteinisatthetop.Theyellowlinesshowtheapproximatelocationsofthelipidbilayermembrane.Theyellow,horizontalFig1.3给出了用于结构和功能研究的内膜蛋白质的纯化和制备流程。都进行了详尽的描述。这一流程主要用于实验的起始阶段。除此之外，本文还给出了相应的线索、要点及有用的策略变化及疑难解答。本文将描述的重点放在了细菌膜蛋白质的纯化及制备策略上，因为这是最常用的。真核膜蛋白质的研究策略目前还有待进一步发展，不过，大部分关于细菌蛋白质操作的常规建议对真核膜蛋白质的研究也是有借鉴意义的。NaturalCloningandExpressionCellmembraneNaturalCloningandExpressionCellmembraneprepDetergentPurityandhomogeneitycheckStructuraland/orfunctionalFig1.3.Workflowoverviewformembraneproteinisolationandpurificationforstructuralandfunctional膜蛋白质的天然来源可以用作纯化的起始原材料。目前报导的膜蛋白质三维结构数据库中，仅有真核细胞的G蛋白偶联受体－牛视紫红质是从天然的牛视网膜中提取的。因为在牛视网膜中，视紫红质具有较高的丰度（8）。然而在大多数情况下，目标蛋白质的低丰度使我们不得不放弃对天然材料的使用。从天然材料中分离纯化膜蛋白质的例子将在本章后面予以介绍用于表达可溶性蛋白质的载体均可用于膜蛋白质的制备。为了提高得到有活性的膜蛋白质的机会，一般建议设计10－50个构建体（包括不同的同源蛋白质）。除了对选择载体的常规考虑之外（见《重组蛋白质纯化手册》参考文献），还有一些应当需要注意的事项：亲和标签的使用极大地推动了基于色谱技术的膜蛋白质的表达筛选及纯化。组氨酸标签是膜蛋白质表达和纯化时最常用的标签，GST标签和其它标签也已经成功用于膜蛋白质的表达及纯化。通常我们会在标签和靶蛋白质之间插入一个蛋白酶的酶切位点，对膜蛋白质进一步分析前除去标签。6个组氨酸标签是可溶性蛋白质纯化时的标准选择，更长的组氨酸标签（8-10个）通常用于膜蛋白质的表达及纯化，在IMC色谱纯化过程中，更长的标签能够提高膜蛋白质同色谱基质的结合强度，进而提高其产量。有报导说更长的组氨酸标签（＞6）的使用在某些情况下会导致膜蛋白质的表达水平下降。并且在洗脱时相应的咪唑浓度也应适当提高。由于膜蛋白质是通过N端信号肽进行插膜过程的，因此标签一般会置于膜蛋白质的C末如果将荧光蛋白质（如GFP）融合在带有组氨酸标签的膜蛋白质上，会我们更容易监测靶膜蛋白质在表达，溶解及纯化过程中的行为，从而可以加速对这些过程的优化（6）为了正确地鉴定靶膜蛋白质的表达与制备最适合的条件及构建体，就要首先建立一个有效的筛选策略。由于膜蛋白质的表达水平很低，因此通常使用亲和标签来富集靶膜蛋白质。过表达是膜蛋白质制备流程中的最大的瓶颈。宿主系统的选择要依赖于对膜蛋白质的要求（如翻译后修饰等）及可操作性（实验室是否有相关设备及操作人员是否具备相关经验）。为了提高成功的可能性，研究人员通常会尝试将同一靶膜蛋白质基因在不同的宿主菌进行表达。此外，研究人员通常还会从不同的种属生物中克隆靶膜蛋白质的同源基因，以选择哪些表达和纯化行为较好的膜蛋白质。E.coliBL21（DE3）和pET系列载体是表达膜蛋白质最常用的宿主菌和载体。即使膜蛋白质的表达水平再高，也要至少比可溶性蛋白质在E.coli中的表达水平低一个数量级。一个不可忽视的瓶颈是膜蛋白质的最终成熟是要通过插入细胞膜得以实现，而细胞膜在细胞中的含量及其有限。有文献报导可以通过使用含有较多内膜成分的宿主菌（Rhodobactersp.(3)）来提高膜蛋白质的表达水平。还有一个办法可以打破因膜含量少对膜蛋白质表达水平的限制，那就是将膜蛋白质表达为包涵体，然后利用去污剂将形成的包涵体溶解、复性而生成有活性的膜蛋白质。目前已有文献报导一些β折叠膜蛋白质可以通过此方法获得（4），而以此方法制备α螺旋膜蛋白质还面临较大困难。本手册将在第3章详细讨论包涵体的相关内容。当使用E.coli作为宿主菌时缓慢的生长和表达速度对于避免包涵体的形成是有帮助的，Table1．1总结了膜蛋白质的不同表达系统。参考文献7综述了膜蛋白质表达时需要考虑的各种大肠杆菌酵母能够对表达的蛋白质进行一些翻译后修饰几种不同的酵母表达系统已经成功用于膜蛋白质的表达（5）同哺乳动物细胞相比，其生长条件相对简单花费更高CHO,BHK和其它细胞株系通常用于受体的功能研究花费很高生长条件更复杂，可以表达毒性蛋白质及体内容易降解的蛋白质花费高GEHealthcare提供的一次性的96孔滤板，预装了针对His和GST标签蛋白质的亲和层析树脂，可用于可重复性的、高通量的蛋白质表达水平筛选。其用途主要包括：不同构建体的表达水平筛选；合适的去污剂及蛋白质溶解性的筛选；小规模纯化条件的优化。该滤板可以预装针对His标签蛋白质NiSephaoseTMHigherformance（HisMultiTrapTMHP）NiSephaose6astFlow裂解缓冲液裂解缓冲液：20mM磷酸钠，100mMNaCl，2mMMgCl2，20mM咪唑于4℃于4℃离心培养液收集菌体，7000－8000g10min或者1000－1500g30min均可弃去上清，置沉淀（菌体）于冰上根据蛋白质对温度的敏感程度，于室温或者4℃轻柔搅拌菌体HisHisMultiTrapTMHP或者HisMultiTrap能够处理96结合缓冲液结合缓冲液：20mM磷酸钠，500mMNaCl，20-40mM咪唑，0.5mMTECP，1-2%20-40mM咪唑对大多数蛋白质都比较合适）。为了提高靶蛋白质的纯度，通常向蛋白质样品及结合缓冲液中加入较高浓度的咪唑，只将滤板倒扣在实验台上，去除顶部密封膜对照组：样品和缓冲液中可以含有还原性试剂。在这种情况下，步骤7须改为如下步骤：向每孔加入500ul洗脱缓冲液。此步骤中的洗脱缓冲液不应含有还原性试剂。200×g离心2min；HisMutiTrap板储存于还原性试剂中。检查离心后是否所有孔都已沥干。如没有，轻微提高离心力，再试一次，直至所有孔都离心过程中，离心力不能超过700g为优化策略，可以改变样品和结合缓冲液中的咪唑浓度。HisMutiTrap常用的咪唑浓度范围是20-40mM。如果在此浓度范围靶蛋白质的结合量太低，可以尝试5-20mM咪唑。一的杂蛋白质（降低靶蛋白质纯度）。过高的咪唑浓度有可能导致靶蛋白质产量的下降细胞收集的方法要依赖于宿主细胞的类型。表达膜蛋白质细胞收集方法和表达细胞内水溶性蛋白质的方法一样，通常使用低速离心机进行细胞收集。预冷的PBS缓冲液中。在4℃，6000-9000g离心15min收集细胞。弃取上清，将细胞重悬于重悬的细胞可贮藏在－80细胞破碎的方法要依赖于宿主细胞的类别。基本上，用于表达膜蛋白质的细胞破碎的方法和表达可溶性蛋白细胞破碎的方法一样。细胞破碎后会产生含有膜蛋白质的细胞膜/囊泡的悬液。悬液中还含有可溶性蛋白质、未被破碎的完整细胞、细胞碎片及其它物质。在膜蛋白质的纯化过程中首先要将这些杂质除去。目前在细胞破碎后标准的分离细胞膜/囊泡的方法是差速离心法。将离心后收集的细胞重悬于合适的缓冲液（如PBS）中进行细胞破碎。加入Dnase可以降低细胞裂解液的粘度，通常还要加入蛋白酶混合制剂（cocktail）来抑制可能发生的蛋白质降解。able12总结了细胞破碎的常用方法及技术。通过将样品从高压腔转入到低压腔时产生的快＋破碎快速有效，通过高频率的声波破碎＋－可导致样品温度升高，－－－用玻璃珠的搅动来磨碎＋对于很难破碎的细胞（如酵母）－从高渗透压转向低渗透＋操作简便，－仅用于外壁较脆弱的细胞（如动物细胞通过反复形成冰晶破碎细胞通常结合酶法裂＋操作简便，＋－－也许会损伤敏感蛋白质或者破坏蛋白质和细胞膜的相互作用－常和其他技术一同使用如反复冻融或渗透压破碎法溶菌酶是破碎细菌细胞壁最常用的＋＋－－MgCl21M溶菌酶超声完毕后，立即进入膜蛋白质的制备步骤本步骤参见参考文献6 细胞破碎后应立即进行膜蛋白质的制备所有操作均应在4℃或冰上进行。将膜蛋白质用液氮速冻，并贮存于－80上述步骤参考于文献6不同细胞破碎方法会导致产生不同大小的细胞碎片，因此需要优化相应的离心速度。缓慢冰冻会产生冰晶，这会对膜蛋白质造成损伤。将膜蛋白质悬浮液速冻于液氮中会产对于不稳定的膜蛋白质，应当在制备完细胞膜之后直接纯化膜蛋白质，从而避免冻存细对于小规模（0.5－50mL菌液）从大肠杆菌进行细胞膜的制备，使用溶菌酶处理细胞后为了推动膜蛋白质的纯化，从大肠杆菌细胞膜提取物中分离内膜和外膜成分是非常有用用2N-lauroylsarcosine溶解（9）。离心1小时后外膜部分会集中于沉淀中，通过对沉有时我们可以省略麻烦且冗长的膜蛋白质制备过程。一个选择是首先破碎细胞，然后直接向细胞裂解物中加入去污剂来溶解膜蛋白质（不需要提前分离细胞膜），通过此法得到的上清可直接用色谱法纯化。一些商品化的色谱柱（如HisTrapTMFFcrudecolumns）具有很好的性质，可以接受将细胞裂解物或去污剂处理后的裂解物直接上样，因此利用这些商品化的色谱柱可以直接从细胞裂解物中纯化带有组氨酸标签的膜蛋白质（见33页“直接从溶解的大肠杆菌粗提物中纯化带有组氨酸标签的膜蛋白质”）。溶解是整个膜蛋白质制备过程中最关键的步骤。通过溶解过程，用去污剂将膜蛋白质从它们所处的自然环境（脂膜）中提取至水溶性环境。去污剂可以打破脂双层，并将膜蛋白质和脂类包裹进去污剂微胶束中。膜蛋白质的疏水表面和脂类分子的疏水尾部都埋藏在去污剂微胶束的内部，而亲水部分则同水溶液的环境接触（Fig1.1）。去污剂可以有效的打破脂类－膜蛋白质、蛋白质－互作用，因此可以用于蛋白质的分离。在去污剂存在下，任何已知的用于水溶性蛋白质的纯化技术均可用于膜蛋白质的纯化。通过成功的溶解步骤可以得到稳定的蛋白质－去污剂复合物（或蛋白质－脂类－去污剂复合物），并且该蛋白质还要保持其具有活性时的天然构象，产率亦应较高。一些膜蛋白质需要和来至脂双层的脂类或外加的脂类相互作用才能保持其天然的活性构象。在这种情况下，溶解方案要确保形成稳定的蛋白质－脂类－去污剂复合物，不再需要去除和靶蛋白质相互作用的天然脂类。粗暴的溶解和纯化策略有可能导致必要的脂类的丢失，进而导致靶蛋白质的失活。去污剂和去污剂是一类两性分子，具有极性（亲水）头和非极性（疏水）尾。极性部分可以是非离子，阴离子，阳离子或两性离子，去污剂也经常按此分类（如极性部分是阴离子的去污剂通常称之为阴离子去污剂）。able13列出了不同类去污剂的优缺点。（一般比较温和，质变性；离子型（阴离子和阳离子）去污剂，如SDS和Choline12）结合了离子型和非离子型去污剂的优点去污剂分子在水溶液中超过一定的浓度，就会以疏水的内部和亲水外部形成多分子的复合物及微胶束。这个浓度就是所谓的CMC。不同去污剂的CMC值是不同的，而且会随着pH值，温度和离子强度的改变而改变。一般来说，用于膜蛋白质制备（溶解、纯化及贮存等）的缓冲液及溶液中的去污剂浓度要Table1.4.SomerecommendeddetergentsforsolubilizationofmembraneBrij™CHAPS(3[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]propanesulfonicacid)Cymal7(Cyclohexyl-n-🞐-D-Decyl<DDM(dodecylFOS-CholineHecameg(6-O-(N-LDAO(lauryldimethylamineNonidetNonylOctylTween™TritonX-N=nonionic;Z=At20°Cto25°Cand~50mM对每一种膜蛋白质都应筛选去污剂及相应条件（浓度）以建立最适合其制备的条件。溶解产量可以通过监测可溶性部分的目的膜蛋白量加以计算。不可溶部分可以通过超速离心的方法去除。目前可以使用商业化的色谱柱或多孔板来从混浊的细胞裂解物中纯化带有组氨酸标签的膜蛋白质（见“Epessinsceeningfhistidine-taggedmembranepteinsfmE.cli.lsates”），过滤可滤去不溶的细胞碎片，使裂解物澄清。除了鉴定膜蛋白质的产量及均一性外，有时还要对其活性进行鉴定，活性能最好的暗示膜蛋白质是否具有天然的构象（和功能）。对于某些膜蛋白质来说，功能实验可以用来检测去污剂溶解的膜蛋白质。还有一些情况，需要将膜蛋白质重新插入到人造的脂双层中才能进行功能实验的测定。Ionic:SodiumdodecylNon-ionic:Octyl

OSO-Na+HOFig1.4.ChemicalstructuresofselecteddetergentsfromthedifferentTris缓冲液20mMpH中性推荐去污剂详见Table1.4.Table1.5.AdditivestoPBSorTrisbufferfordetergentMembraneproteinconcentration(%)NaClStart2Variation1to0.4to2(alwaysaboveCMC)100to4to5min–5在4100000×g离心45minproteinsfromE.colilysates”也适用于溶解筛选和结合筛选实验。EM29，一个带有组氨酸标签的表观分子量为29000的大肠杆菌膜蛋白质的溶解筛选的结果见1.5。在期望的位置处有一条很强的条带，暗示其表达水平较高或溶解比较充分。对于FC12，TritonX-100和LO能给出较弱的条带，而其它去污剂则不能，说明这些去污剂不太适合FC12的溶解。需要小心的是，得到合理的较高的产量同时，一定要考虑膜蛋白质在去污剂溶液中的稳定性及活性。这也是下一步筛选分析需要考虑的。FC12DDMCymal6TX- DDMCymal6TX-UDMCymal5 UDMCymal5 UDMCymal5

OG=octylglucoside;TX-100=TritonX-100;LDAO=lauryldimethylamineoxide.DatakindlyprovidedbyDr.Said一些特殊的脂类也许在天然的细胞膜中就和蛋白质是耦联在一起的，它们的存在对膜蛋在起始溶解实验中，DDM通常是一种较好的去污剂。为了优化溶解条件以获得较高产量的GST标签的膜蛋白质，Fig1.6给出了一个简单快速的方法。对GlutathioneSepharose4B介质的结合能力。96-well

DeterminethedetergenteffectontheenzymaticactivityofpurifiedGSTwiththeCDNBassaySolubilizemembranesindifferentdetergentsandconcentrationsthatdonotaffecttheactivityoftheGSTtagPurifyfusionproteinusingGSTSpinTrapPurificationModuleAnalyzeyieldbySDSandactivityofmembraneprotein(ifassayisavailable)GSTGSTDetectionGSTMultiTrap4B如果GST在选择的去污剂中酶活性（作为GST结合能力的标尺）是未知的，可以用GSTDetectionModule中提供的CDNB实验来评价去污剂中GST的酶活性，只要比较一下GST碎方法，这种情况下则需要更高的离心力和更长的离心时间（如100000×g离心60min）。从离心后的上清取出500ul，根据厂商说明书用GSTSpinTrapTMPurificationModule或本策略参考于文献10在建立初始的溶解条件之后，需要通过进一步对更多的去污剂的筛选来优化溶解条件，下面给出了优化时需要考虑的各项参数：蛋白质和去污剂的浓度比。通常蛋白质的浓度范围是溶解时间和混合强度（如温和搅拌、上下旋转或剧烈搅拌等蛋白质颗粒的均一性也能用作膜蛋白质稳定性的指标（可用此作为溶解条件优化的指标）。因S00L层析柱来快速评价膜蛋白质的颗粒均一性（见“Sizehomogeneitycharacterization”）。Fig1.7给出了如何用SupedexTM2005/150GL层析柱在不同pH和盐浓度条件下筛选膜蛋白质颗粒的均一性。也可以考虑使用去垢剂的混合物。使用添加剂如脂类和小的两性分子（如1,2,3-heptanetriol）或者已知的靶蛋白配体可以pH pH pH0.3significantpeakswereobtainedclosetothevoidvolume,indicatingsevereoligomerizationoraggregation.优化以后，根据所需提纯的膜蛋白数量来进行溶解建议溶解后立即进行纯化，使得膜蛋白由于聚集、结构破坏或者蛋白酶水解所造成的活适于溶解某种特定膜蛋白的一种去垢剂很可能对该蛋白进行其它操作（如结晶）。在关于膜蛋白纯化过程中如何使用去垢剂的综述，请参见参考文献11和12用有机溶剂有时可能将小而稳定的膜蛋白以活性状态从脂双层中提取出来。例如，用氯仿和乙醇混合液从E.coli中提取一个110个氨基酸的膜蛋白，第一步是在这个环境中使用抗有机溶剂的色谱层析介质和柱子来进行的（图1.8；13）。使用1：1的氯仿和乙醇混合液来提纯这个膜蛋白能够获得最佳分离效果。 Sephadex™LH-20(40mlbedvolume)in10mmdiameter OrganicextractofE.colimembranesinwhichEmrE(amultidrugresistancetransporterprotein)wasoverexpressed Chloroform(C):methanol(M)3:1(upper)andC:M1:1 3:13:11:1 Fig1.8.Gelfiltrationseparationofsolvent-extractedmembraneproteins.Solidline=organicchloroform(C)andmethanol(M)wereused.TheasteriskmarksEmrEcontainingpeaks.From膜蛋白通常是作为蛋白－脂类－去垢剂的复合物来进行纯化的。这个复合物在水环境中的溶解度允许采用与水溶性蛋白质本质上相同的分离技术。主要区别在于进行膜蛋白纯化需要在所有溶液中都含有去垢剂。因为蛋白质－去垢剂复合物是动态的，在自由去垢剂分子不存在的情况下，去垢剂分子会立即解离下来。去垢剂分子的浓度应该在其CMC值以上但是可以固定在溶解时所加浓度的10倍以下（通常是在01％的浓度范围内）。高去垢剂浓度能够降低蛋白质的溶解度。但是，如果膜组分的浓度很高，在溶解期间需过度纯化能够导致宝贵的膜脂从蛋白质－脂类－去垢剂复合物上脱离下来，同时也会丧在整个纯化过程的所有缓冲液中加入5％甘油通常能够提高膜蛋白的溶解度。组氨酸标签蛋白对于Ni2+以及其它几个金属离子具有亲和性，使用螯合配体能够将这些金属离子固定在色谱层析介质上。含有组氨酸标签的蛋白能够特异性地结合在带有金属离子的介质上如iSephaseigherfrmance(P)andiSephase6astlw()，而大多数其它胞内蛋白不能结合或者结合很弱。提高咪唑的浓度可以将蛋白洗脱下来。这种色谱层析技术通常被称为螯合金属离子亲和层析（C）。带有6个组氨酸标签的水溶性蛋白通常可以参照标准流程直接进行纯化。时较麻烦，与IMC结合较弱。这可能是由于去垢剂与蛋白的结合限制了组氨酸标签与IMC配体之间接触。为了解决这个问题，一般采用更长的组氨酸标签来进行膜蛋白过表达。另外，在组氨酸标签和目的膜蛋白之间加入连接片段如绿色荧光蛋白（GP）可能会帮助结合C介质。过去相当长一段时间内，人们经常使用批量方法来纯化组氨酸标签的膜蛋白。批量纯化是指在一个指定时间内将样品与色谱层析介质在一个开放的容器内混合，一般是过夜混合。然后，将这个悬液装入一根柱子内进行漂洗以及洗脱。批量纯化有时能够提高产量，因为样品与介质的吸附时间比柱上分离要长。另一方面，正因为实验过程长，批量纯化会使得蛋白更易于遭受到蛋白酶降解或者导致失活，并且因此降低纯化蛋白的质量。组氨酸标签的膜蛋白的纯化也可以用柱分离方法来进行（参见下一页的实验流程）根据最后使用上时所需纯度标准，可以在IMAC以后利用其它步骤来进一步纯化。为了这个目的，最常使用分子筛层析，这种方法的优势在于不需要优化。也可以在IMAC层析和分子筛层析两个步骤之间使用阴离子交换层析（参见本章节后期“其它的纯化步骤”部分）。结合缓冲液：PBS,20mMimidazole,0.1to1%detergent(e.g.,DDM),pH洗脱缓冲液:PBS,0.5Mimidazole,0.1to1%detergent(e.g.,DDM),pH该纯化步骤应该在4℃进行。除去柱子出口处的转接头可以使用更高的流速。参见柱子使用说明建议使用相对低的NaCl浓度（如PBS是150mMNaCl），因为膜蛋白在高离子强度下溶解度降低。通常建议使用较高浓度（如300－500mMNaCl）来进行水溶性蛋白的IMAC低杂质与色谱层析介质之间的离子相互作用。在一些情况下，应该使用更低的NaCl如上面流程所述，在IMAC上使用梯度洗脱（不断增加的咪唑浓度），可以将只在脂类含在上样期间，降低流速可以增加产量。蛋白，该蛋白是在Ecoli中过表达的一个C端带有8个组氨酸标签的GFP融合蛋白，在该蛋白上还有一个tobaccoetchvirusTEV)蛋白酶切割序列。

Fig1.9.Two-steppurificationofE.coliYedZ-TEV-GFP-(His)8fromsolubilizedmembranespreparedfromE.colicellculture.Fractionsfrom(A)IMACwerefurtherpurifiedby(B)gelfiltration.(C)SDSanalysisofselectedfractions=molecularweightmarker.PeakEmostlikelycontainedlight-scatteringdetergent-lipidaggregates.Datakindly.本流程围绕膜制备和离心的需要而展开。使用一个专门用于处理未经过滤的粗提细胞裂解物的色谱层析柱。柱子：HisTrapFFcrude,1结合缓冲液：PBS,40mMimidazole,0.1%detergent(e.g.,DDM),pH洗脱缓冲液:PBS,1Mimidazole,0.1%detergent(e.g.,DDM),pH除去柱子出口处的转接头未经过滤的裂解物体积因每一个特定样品而定建议在上样期间持续地、轻柔地搅动样品以防止沉淀。在4℃上样可以防止样品粘度增一步一步进行洗脱 HisTrapFFcrude,1 E.colicelllysate,withoverexpressedYedZ-TEV-GFP-(His)8solubilizedin0.8%dodecylmaltosidefor100minonice.Sampleload:50Bindingbuffer:PBS,40mMimidazole,0.1%DDM,pH7.4Elutionbuffer:PBS,1Mimidazole,0.1%DDM,pH7.4Flowrate: 1ml/min 4%to12%elutionbufferin10ml;12%to100%elutionbufferin5

YedZ-TEV-GFP-

%Elution

14 14 Fig1.10.Purificationofa(histidine)8-taggedmembraneprotein,YedZ-TEV-GFP-(His)8directlyfromcrude,GFP);gray=conductivity;red=%elutionbuffer.TheoverexpressionvectorwaskindlyprovidedbyDrJ.-W.deGier,在应用上需要进一步纯化IMAC纯化过的组氨酸膜蛋白以满足对高纯度均一物质的需求（如结构鉴定）。一个或者更多色谱层析步骤就足矣了。为了达到最高纯化效率，需要将各种分离原理运用在纯化流程的不同步骤中。一个高效的纯化流程是由IMAC（根据特异性亲和进行分离），脱盐和离子交换层析（根据电荷不同进行分离），最后是分子筛层析（根据大小不同进行分离）。分子筛层析最常用于最后一步纯化以最后除去聚集体并且还可用于将样品更换到适于进一步功能和结构研究的缓冲液中。分离是在高于CMC值的去垢剂存在情况下进行的（一般是大于0.1％）。其它条件和提取水溶性蛋白是一样的。表1.6列举出了一些合适的柱子。ÄKAxpress™层析系统可以在最短操作时间内进行多步自动化纯化来生产高纯度的蛋白质。附录2展示了ÄAdesignM系统。高效阴离子交换层析既可用于纯化也可对纯化好的膜蛋白的电荷均一性进行鉴定。在大多数情况下，在上样到离子交换层析柱以前，要降低IMAC处理过的样品中离子强度。1.14给出了使用no™对C纯化过的膜蛋白进行电荷鉴定的实例。柱体积阴离子交换层析柱，Mini0.24或阴离子交换层析柱，1或强阴离子交换介质；HiTrapQ1或强阴离子交换介质；同上，同上，HiTrapQ1或强阴离子交换介质；HiprepTM16/10Q同上，HiTrapDEAE1或弱阴离子交换介质；是强的QHiTrapTM16/10DEAE同上，阳离子交换层析柱，Mini0.24或阳离子交换层析柱，1或强阳离子交换介质；HiTrapSP1或强阳离子交换介质；同上，同上，HiTrapSP1或HiprepTM16/10SP同上，用于高分辨分离分子量范围10000－600000的膜蛋白质－去污剂复合物上样量最大用于高分辨分离分子量范围10000－600000的膜蛋白质－去污剂复合物上样量最大5ml（120ml层析柱用于高分辨分离分子量范围000的蛋白质，上样量最大用于高分辨分离分子量范围3000－70000的膜蛋白质－去污剂复合物，上样量最大5ml（120ml层析柱）12ml离子强度对膜蛋白的溶解度影响很大。以一定的盐浓度梯度从离子交换层析上洗脱下来分子筛层析很适于作为最后一步纯化步骤，因为它既可以除去聚集体，同时还可以达到如果蛋白酶切割位点位于标签和目的蛋白之间可以在纯化之后将标签切割下来。使用ÄKAxpress系统可以自动进行标签的柱上切割。去垢剂的存在能够影响蛋白酶的活力。关于各种蛋白酶在去垢剂中的活力信息十分匮乏。但是，PeScission™蛋白酶和凝血酶可以同去垢剂一）。PreScission™蛋白酶在4℃呈现出良好的切割活力，对于切割温度敏感的蛋白来说是一个天然资源比异源宿主更适于作为原材料来提纯膜蛋白。由于缺乏亲和标签以及因此而采用的高度特异性的初始纯化步骤，通常需要联合使用多种经典的蛋白质纯化技术才能达到足够的纯度。表1.6列举出的柱子连同其它层析技术所用层析柱一起也经常用于无标签膜蛋白的纯化流程。详情请参见本丛书的“蛋白质纯化手册”。离子交换层析也经常作为主要步骤用于无标签膜蛋白的纯化。1.11是采用阴离子交换层析来进 HiTrapQHP,1 Solubilizedhumanerythrocyte 0to500mMNaClin15ConcentrationConcentrationNaCl

Elutionvolume

如上所述，在膜蛋白的纯化流程中，分子筛层析是理想化的最终步骤。在分子筛上可以除去聚集体以及与目的蛋白分子大小不同的杂质，同时还可以进行缓冲液更换。1.12是重复性使用分子筛层析作为最后纯化步骤从HEK293细胞中来进行牛肌氨酸转运蛋白的提取实验。将膜溶解在癸胺中，第一步纯化是在植物凝集素柱上进行的（将麦芽凝集素螯合在柱子上）。第一次分子筛纯化产生了一个宽而不对称的峰（1.12，上）。在同一根柱子上进行的第二次分子筛纯化产生的对称峰，标志着蛋白是均一的。用SS-GE来鉴定纯度。-

Volume VolumeFig1.12.PurificationofthebovinecreatinetransporterfromHEK293cells.Membranesweresolubilizedwithdecylwhichyieldedmultiplepeaks.(B)Materialinthepeakfractions(shownbytheshadedbar)wasconcentrated.Re-DeepPurpleTM（用于荧光检测）可用于检测。通常使用Laemmli系统（19）。下面总结了一些 煮沸用SDS处理过的样品会导致膜蛋白的聚集。可以在60°C30min温育60min，这些对于制备SDS样品都是有效的替代方法。另一方面，一些膜蛋膜蛋白通常不会迁移在SDS上预测分子量的位置处。它们一般会迁移得快一些（也就是看起来较小），了更多的SDSSDSClean-Up试剂盒已经成功用于处理那些含有干扰性去垢剂或者对于SDS蛋白质聚集对于膜蛋白而言是一个普遍的问题。聚集的发生通常是不可逆的，并且可能是随着时间缓慢进行着，但是有时也会随着离子强度、pH、蛋白与去垢剂的比例以及其它因素的有限变化而快速又出乎意料地发生。了解聚集程度对于监测膜蛋白的活性十分重要。聚集通常不能用SDS-GE来进行监测，因为SDS能够溶解大多数聚集体。分子筛层析是监测聚集的快速方法，可以在很广泛的条件下使用。这种方法可以有效地由于监测纯化的膜蛋白样品的分子量均一性。比较不同的去垢剂时，分子筛可用于监测去垢剂与蛋白质复合物分子量上相对较小的变化。分子筛经常用于指示不同去垢剂对于某一特定蛋白的适用程度。因此，分子筛对于定量分析为进一步分析而制备的膜蛋白是一种重要的分离工具。例如，分子筛经常用于评定不同去垢剂对于膜蛋白结晶的适用程度。但是，在一些情况下，膜蛋白的结晶条件看起来并不是让蛋白质在制备时呈现很均一的状态。用两个柱体积的缓冲液平衡柱子用两个柱体积的缓冲液平衡柱子让蛋白在该缓冲液中平衡以避免在分子筛运行期间去垢剂－膜蛋白复合物发生聚集或者解聚时间大约是6min。（1.7）。用两个柱体积的缓冲液平衡柱子用两个柱体积的缓冲液平衡柱子解聚。检查样品是否混浊。如果是10000g，离心10分钟。使用Superdex2005/150GL柱子在仅仅6分钟内可以在相对较低分辨率得到相同的信息Zinctransport Unknown Mg2+/Co2+transportFig1.13.Sizehomogeneitycharacterizationofmembraneproteinsbygelfiltration.IMACpurificationsofthreeE.proteindidnotaggregate,indicatingthatpurificationwassuccessful.Blueline=A280trace.Fromreference20.高分辨率的阴离子交换层析广泛用于膜蛋白的纯化，通常在IMAC后作为第二步色谱层析步骤。它也是一种对纯化的膜蛋白进行电荷均一性鉴定的好方法。1.14是对一种在E.coli中过表达的膜蛋白复合物－组氨酸标签的细胞色素泛琨氧化酶的IMAC纯化产物中获得的组分进行电荷均一性鉴定的结果。第一个IMC组分在MonoQ上得到了一个侧峰（左）。用SDS-GE确定纯度。第二个IMC组分在MonoQ上得到了一个单而窄的对称峰。用SDS-PGE来鉴定纯度，结果显示有4条带，分别对应于58K33K、22K17K。MEFTF1 MonoQHR 2.5mloffractionBindingbuffer:20mMTris-HCl,pH1%octyl--d-Elutionbuffer:Bindingbuffer+1MNaCl 0%–50%elutionbufferin20CV 1ml/min

MonoQHR 3.0mloffractionBindingbuffer:20mMTris-HCl,pH1%octyl--d-Elutionbuffer:Bindingbuffer+1MNaCl 0%–50%elutionbufferin20CV 1ml/min mAU(280

mAU(280

%Elution

纯化好的膜蛋白经常需要被浓缩或者转移至一个适于进一步分析的环境中。通常的操作包括浓缩、脱盐、更换缓冲液、更换去垢剂以及清除去垢剂。下面给出了这些操作的流程。超滤技术通常用于膜蛋白。他们通常也浓缩去垢剂胶团并且因此改变去垢剂与蛋白质的比例，这将导致沉淀的发生。另一个可能的问题是在滤膜表面蛋白质浓度的提高会导致聚集和沉淀。柱层析是另外一种比较温和的浓缩技术。IMAC很适于浓缩组氨酸标签的蛋白质，而离子交换层析既用于带有标签的蛋白质，同时也用于无标签蛋白质的浓缩。小直径（10to35μm）和单分散性色谱层析树脂很适于使用，因为它们在洗脱时能够使得条带宽度最小化。在柱上浓缩后可能需要利用脱盐来除去咪唑或者盐。HisTrap可以用于在温和条件下浓缩纯化的组氨酸标签膜蛋白。在中性pH条件下，纯化的蛋白质吸附在含有0to20mM咪唑的缓冲液中。Mg数量级的蛋白质一般都能吸附上但是最大的柱结合能力是因蛋白而异的。洗脱是按照需要用0.5to1M咪唑在一步内完白的浓缩。洗脱是用高盐（如0.5to1MNaCl）或者改变pH在一步内完成的。纯化流程用于膜蛋白的脱盐步骤是使用缓冲液中的去垢剂，但是其它步骤与水溶性蛋白相同每次纯化的样品体积illustra™MicroSpin™G-离心（用于离心柱DisposablePD-10手动（重力HiTrap色谱系统，统（当分别使用2或3根柱子串联HiPrep26/10色谱系统（当分别使用2，3或4根柱子串联时样品体积可上升至30－45ml）每个产品都配有推荐的处理流程。总体概述如下用合适的缓冲液平衡柱子用合适的缓冲液平衡柱子上样应该不要超过最大的推荐样品体积洗脱，并在建议分装体积内收集蛋白物质有很多原因需要更换去垢剂。无论是从经济角度和操作角度考虑，通常要把溶解和/或者纯化用的去垢剂更换成一种更加适于进一步分析用的去垢剂。一般采用透析来达到这个目的，但是这种方法往往效率不高。低CMC值的去垢剂透析效果很差，因为去垢剂胶团缓慢透过或者干脆就不能透过透析膜。由于一些原因，超滤方法可能效率也不高。除了通透性的问题，在透析/超滤膜的附近蛋白浓度变得很高，这容易导致大范围聚集。在柱上进行缓冲液更换通常较缓和并且高效。这种方法的一个明显缺陷是洗脱缓冲液可能含有杂质，这需要从洗脱下来的膜蛋白中除去。如上所述，这个问题可以通过脱盐以及更换缓冲液的方法来得以解决。用QSepharoseFastFlowRESOURCEQ对纯化的膜蛋白进行缓冲HiTrapQFF1mlHiTrapQFF5mlRESOURCEQ,6使用柱子说明书中的建议流速。以及去垢剂浓度。适合的缓冲液是50mMTris-HCl50mMNaClpH8.0。上样用5－12个柱体积的含有另一种去垢剂的低离子强度缓冲液来漂洗柱子。可以在更高的盐浓度来进行洗脱该处理过程取自于文献21和22 在该流程中避免使用阴离子去垢剂。用0.51M咪唑在一步内进行洗脱。之间的结合。最初的文献（23）使用的是另一种Sepharose介质而不是下面列举的这些现在所使柱子的选择柱子的选择HiTrapPhenylFF(highsub),1mlHiTrapPhenylHP,1ml缓冲液:20mMTris-HCl,1mMEDTA,等于或者略大于CMC值的合适去垢剂,pH8－9样品:1－4mg/ml,保存在0.5－1ml缓冲液中的膜蛋白，其中的去垢剂即将被除去用溶解在缓冲液中的另一种去垢剂来饱和柱子用溶解在缓冲液中的另一种去垢剂来饱和柱子。去垢剂浓度应该是大于或者略等于其CMC值对于能够耐受有机溶剂的膜蛋白，可以使用反相层析（RPC）介质（如RESOURCERPC1蛋白质组分析的一个目的是鉴定并且定量细胞或者组织中在某一特定时间表达的所有蛋白。实现这一目标所采用的标准方法是首先用二维电泳分离蛋白质，接下来用质谱（MS）分析胰蛋白酶消化的蛋白质。但是，细胞表面蛋白尤其是嵌合膜蛋白，如果未经色谱层析或者其它富集手段初步分离，很难用二维电泳进行监测。这是由于这些蛋白的低丰度、溶解膜蛋白以及维持它们在一维电泳分离（等电聚焦）中溶解度的困难性所造成的。在一个初步分离的实例（24）中，Sacchaomcesceevisiae的线粒体蛋白在二相系统中分离出来（1.15），该系统由一个多聚体和一个非离子去垢剂组成。膜蛋白富集在去垢剂相中，然后用于离子交换层析。洗脱下来的组分用SDS-PGE进一步分离，目的条带用MS进行分析。蛋白都是采用这种方法进行鉴定而不是单纯的二维电泳。S.(membrane

(solubleIonexchangeSDS-MS这些特征使得我们可以使用EttanTMDIGE技术进行multiplexing，以及使用DeCyderTM2-D软件来分析蛋白质表达情况。用此方法，在蛋白质丰度上一些微小的变化也可以被高精确的检测出来，并且检测结果可以用优化的统计办法进行分析，igue116给出了详细的策略。Fig1.16.Outlineofaprocedureforselectivelabelingofcell-surfaceproteinsusingCyDyeDIGEFluorminimalHanksHanksBufferedSaltSolution标记缓冲液:HBSS1M尿素pH裂解缓冲液:7M尿素2M硫脲,4CHAPS30mMTris5mMMgAC2pHCyDyeDIGEFluorminimalCyDyeDIGEFluorminimal染料对收集细胞进行计数，离心。从此步骤开始到实验结束，要保证细胞始终处于冰上需要再温育10min以彻底终止反应。细胞于410000×g离心5min，弃去沉淀，将上清转移至一个新的离心管中。证实样品中是不含有标记的细胞质蛋白质。样品分离后可直接用于2-D电泳。向裂解的细胞表面标记样品中加入2×样品缓冲液，至此样品随时可以用于2-D电泳。具体操作参照2-DDIGE电泳推荐策略。Table1.7总结了膜蛋白质2-D电泳相关疑难问题的解决办法。更多关于2-D电泳的信息参见2-DElectrophoresis-PrinciplesandMethods.用CyDye不均匀的，标准2-D跑2-D另外一个可选择的2-D电泳的方法是“shotgunpoteomics”，该方法是先进行蛋白质水解，然后用液相色谱分离降解的肽段，最后用质谱MS/MS进行测序分析。为了应用此方法对膜蛋白质进行研究，首先要通过细胞破碎和差速离心法制备细胞膜成分（方法参见able1.2）具体的离心策略要根据研究的细胞类型而定。able18列出了关于膜蛋白质溶解和水解的一些备选策略。Vogeley,L.etal.Anabaenasensoryrhodopsin:Aphotochromiccolorsensorat2.0Å.Science306,1390–1393(2004).Ferguson,A.D.,etal.Siderophore-mediatedirontransport:CrystalstructureofFhuAwithboundlipopolysaccharide.Science2822215–2220(1998).Laible,P.etal.Membraneproteinproduction.BIOforumEurope,9(4),42–44Bannwarth,M.andSchulz,G.E.TheexpressionofoutermembraneproteinsforMembraneproteinpurificationandcrystallization(Hunte,C.etal.,eds.),AcademicPress,Amsterdam,pp.55–70(2003).Drew,D.etal.OptimizationofmembraneproteinoverexpressionandpurificationusingWagner,S.etal.Rationalizingmembraneproteinoverexpression.TrendsinBiotech.24,364–371(2006).Palczewski,K.etal.Crystalstructureofrhodopsin:AGprotein-coupledreceptor.Science289,739–745(2000).Beis,K.etal.CrystallizationandpreliminaryX-raydiffractionanalysisofWzaoutermembrane Lundbäck,A.-K.etal.OptimalsolubilizationscreenstrategiesforGST-fusionmembrane leMaire,M.etal.Interactionofmembraneproteinsandlipidswithsolubilizingdetergents. 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