乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测

乙型肝炎病毒核苷(酸)类似物耐药监测

缪晓辉.5乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测1/58一、HBV耐药相关定义二、各种耐药检测技术评价三、需要重视几个问题乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测2/58一、HBV耐药相关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough)病毒反跳（viralrebound)生化学突破（biochemicalbreakthrough)HBV基因型耐药（genotypicresistance)HBV表型耐药（phenotypicresistance)临床耐药（clinicalresistance)乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测3/58HBV耐药相关定义

病毒学突破（virologicbreakthrough)指在核苷类药品治疗过程中，患者血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA水平与最低值相比上升或超出1个log10（10倍)。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测4/58HBV耐药相关定义

病毒反跳（viralrebound)指核苷类药品治疗过程中患者血清HBVDNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBVDNA升高至＞2×104IU/mL或高于治疗前水平。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测5/58HBV耐药相关定义

生化学突破（biochemicalbreakthrough)指在核苷类药品治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT)水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，不过在此仅指ALT。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测6/58HBV耐药相关定义HBV基因型耐药（genotypicresistance)指HBV基因组中一些位点发生改变，造成这种药品对HBV抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV耐药性有直接因果关系，经过这些变异位点检测可判断HBV有没有耐药性。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测7/58HBV耐药相关定义HBV表型耐药（phenotypicresistance)经过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药品敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶活性，敏感性降低或酶活性下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评定IC50＜5倍:敏感IC50在5～10倍:部分耐药IC50＞10倍:耐药乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测8/58HBV耐药相关定义

临床耐药（clinicalresistance)指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBVDNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发其它临床证据。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测9/58二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破监测HBV基因型耐药监测HBV表型耐药检测临床耐药监测乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测10/58病毒学反跳或突破监测基于对血清HBVDNA载量动态监测需重视以下三点:1.HBVDNA载量检测伎俩敏感性2.检测技术可靠性和稳定性3.监测间隔时间乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测11/58HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测12/58基因型耐药相关变异命名乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测13/58基因型耐药相关变异

在HBV多聚酶序列中位置乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测14/58HBV基因型耐药主要技术碱基序列分析法

直接测序

克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNO—LiPA)基因芯片技术实时荧光定量PCR技术

探针定点突变PCR技术

引物末端碱基定点突变扩增技术

熔解曲线法基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测15/58直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸ssDNA，从而完成测序方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定裂解DNA片段，产生一簇各种长度短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA次序。类似末端终止法，所不一样是用荧光染料标识，计算机自动读出。优点简便、快速、应用广泛。不需酶促反应，能够对寡核苷酸测序。①简便、快速、准确可靠。②安全、无放射性污染。③模板用量大大降低。④测序能力增强。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测16/58HBVYMDD变异直接测序结果图谱乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测17/58直接DNA测序不足1.设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充分目标基因片段。3.突变株百分比小于20%时，因为竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBVYMDD变异1.JPG乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测18/58克隆测序法乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测19/58克隆测序法优点:1.有利于发觉混合株并可大致确定不一样序列毒株

之间相对比。2.提升了检测灵敏度。不足:1.技术难度较高。2.检测周期更长。3.检测费用大大增加。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测20/58

碱基变异可能造成:

①原有位点消失

②产生新位点

③识别位点移位利用错配引物使PCR产物中产生特异酶切位点结果:酶切片段长、短改变和多、少改变聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测21/58限制性内切核酸酶作用它们能识别DNA特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如:NdeI限制酶识别序列和切割位点:CA

TATGGTATACNlaIll限制酶识别序列和切割位点:CATGNNNGTACNNN乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测22/58PCR-RFLP检测HBVYMDD变异PCR错配引物设计乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测23/58PCR-RFLP检测HBVYMDD变异乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测24/58PCR-RFLP检测HBVYMDD变异乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测25/58PCR-RFLP技术评价优点:

简单、广泛易开展。缺点:1.限制性内切酶种类有限。2.错配引物将造成退火温度降低、非特异条带增多。3.引物非完全匹配，可能造成扩增效率降低、检测

敏感下降。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测26/58反向杂交分析技术（INNO—LiPA)乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测27/58INNO—LiPA诊疗HBVYMDD变异乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测28/58DNA芯片技术BiologicalSampleAnalyzedataScannermicroarray"Hybridize”arrayerMicroarrayfabricationSamplepreparationMolecularhybridizationDetectionandanalysis乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测29/58DNA芯片技术诊疗HBVYMDD变异DetectionofYMDDMotifMutantsbyOligonucleotideChipsinLamivudine-UntreatedPatientswithChronicHepatitisBVirusInfection。JKoreanMedSci;19:541-546.乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测30/58DNA芯片技术优点不足大通量技术和设备要求高快速检测成本高灵敏度高可平行检测

乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测31/58实时荧光定量PCR在基因变异中应用探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针引物末端碱基定点突变扩增技术高分辨熔解曲线法乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测32/58Taqman-MGB探针定点突变PCR技术乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测33/58Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异HBVDNA>105copies/mlW:M=1:1HBVDNA>105copies/mlW:M=10:1HBVDNA<105copies/mlW:M=10:1:W:M乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测34/58探针定点突变PCR技术

优点不足

灵敏度高需要相对较贵荧光PCR仪

特异性好需要多条荧光探针,成本高

费时短影响原因多,存在一定误判乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测35/58引物末端碱基定点突变扩增技术乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测36/58引物末端碱基定点突变扩增技术

检测YMDD变异乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测37/58熔解曲线法检测YMDD变异特异性探针,其Tm值不一样溶解曲线分析乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测38/58基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)原理乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测39/58MALDI-TOFMS检测

HBVYMDD变异原理酶切分子量.JPG乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测40/58基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)优点：

高灵敏度、准确度、分辨率

能发觉相对百分比小于1%变异株。不足：

设备昂贵，当前国内难以用于临床检测。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测41/58HBV耐药不一样检测技术比较AdvancesinMolecularDiagnosisofHBVInfectionandDrugResistance。Int.J.Med.Sci.2(1):8-161Sensitivityherereferstothelowestlevel(%)atwhichanassaycandetectmixturesofmutantandwild-typevirus.2Informationcontentisconsideredasameasureofatest’sabilitytoprovidebroad,relevantinformationaboutpossiblenewmutations.3Updateabilityassessestheeaseatwhichatestcanbedaptedtoincorporatethedetectionofanewmutation.na,notapplicable.nd,notdetermined.乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测42/58HBV表型耐药检测有两种路径:1.细胞外HBV聚合酶活性分析。2.细胞药品敏感性试验。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测43/58细胞外HBV聚合酶活性分析当前惯用研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体,继而转染昆虫细胞而表示HBV颗粒,应用亲和层析法纯化HBV颗粒后,在细胞外评价药品对聚合酶活性影响。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测44/58细胞外HBV聚合酶活性分析乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测45/58细胞药品敏感性试验该方法类似于细菌药品敏感试验。当前多采取病毒载体将含有被检测含HBV变异位点全基因组导入肝细胞源性细胞株,然后将各种浓度核苷类药品加入培养液,经过一定时间培养后检测细胞上清中HBVDNA含量。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测46/58细胞药品敏感性试验乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测47/58细胞药品敏感性试验该技术在操作上非常繁琐,当前仅限于研究之需,主要用于药品开发研究,尚不能用于常规临床分析。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测48/58临床耐药监测YMDD变异前后病毒载量和ALT改变乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测49/58HBVMDD变异与病毒学突破乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测50/58判断临床耐药时提议1.结合核苷类药品应用史、起始病毒载量、是否合并其它肝病等。2.注意甄别依从性不良。3.结合基因变异位点。乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测51/58三、需要重视几个问题慎重对待天然耐药结论。不要过分依基因型耐药检测技术。正确对待基因分型技术。

乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测52/58YMDD自然变异几组数据AkarsuM等采取InnoLipa法检测71例未经抗病毒成年慢性乙肝携带者，结果有13