疫细胞功能检测技术

第十五章免疫细胞功能检测技术第一节淋巴细胞的功能检测淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应;体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定

淋巴细胞T细胞（负责细胞免疫功能)B细胞（执行体液免疫功能)NK细胞（非特异性免疫作用)一、T细胞功能的检测T细胞增殖试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验原理:01.淋巴细胞01.DNA合成01.分化01.母细胞01.刺激物01.细胞变大01.细胞浆扩大01.空泡01.核仁明显01.核染色质疏松01.（一)T淋巴细胞增殖试验PHA------T细胞非特异性刺激物:1异种抗原同种组织抗原特异性刺激物:3ConA-------T细胞PWM-------T、B细胞LPS-------B细胞22.淋巴细胞转化的刺激物检测方法01形态法：刺激物

淋巴细胞（4-6天)母细胞化同位素法：PHA淋巴细胞（54h)DNA合成期+3HTdR掺入

收集细胞02测定细胞内的3H－TdR03（1)形态学检查法A优点:形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察结果，适于基层实验室应用。

B缺点:是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。

方法学评价:培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性（2)3H-TdR掺入法优点:3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点:但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。

(3)MTT比色法培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性MTT测吸光度(二)T细胞分泌功能测定体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平,以反映T细胞功能。

原理:01靶细胞抗原02T细胞03观察杀伤活力04致敏CTL05靶细胞06（三)T细胞介导的细胞毒试验形态学方法:淋巴细胞+肿瘤细胞

计数残留肿瘤细胞01方法02意义:肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力

0351Cr释放法靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时特异性抗原皮肤试验01PHA皮肤试验02(四)体内试验B细胞增殖能力的试验溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验二、B细胞功能检测B细胞增殖形态学细菌脂多糖SAC的SPA 3H－TdR掺入法抗IgM(一)B细胞增殖能力的试验(二)溶血空斑试验原理:2.方法学:经典溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。3.临床应用与评价原理:B细胞抗体形成功能的检测

——酶联免疫斑点法该方法既可检测抗体分泌细胞,又可检测抗体分泌量。

优点：稳定、特异、抗原用量少;可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量;可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。

2．应用与方法学评价:体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫,并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血,分离血清,测定受检者免疫前后相应抗体的效价,判断受检者体内B细胞的功能。

(四)体内试验三、NK细胞活性测定染色计数离心取上清测LDH或AKP离心取沉淀测活细胞荧光测发光强度测CPM值形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法靶细胞溶解常用靶细胞:

K562细胞株按其形态大小分为两类:大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统小吞噬细胞—中性粒细胞第二节吞噬细胞功能检测技术趋化吞噬胞内杀灭作用吞噬细胞的功能:01中性粒细胞功能的检测02细胞趋化功能的检测吞噬和杀菌功能的检测(一)细胞运动功能——趋化功能检测原理:2.方法学:滤膜渗透法（Boyden小室法)琼脂糖平板法显微镜检查法:吞噬和杀菌功能测定2.溶菌法NBT还原试验NBT还原试验

原理:N-N-C+H+N=N-R-N-NH2CN=NH四氮唑基（淡黄色)甲chan（紫黑色)NBT01甲撍颗粒沉积于胞质中02中性粒细胞二、巨噬细胞功能检测炭粒廓清试验正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判断巨噬细胞的功能。(二)吞噬功能检测巨噬细胞对颗粒性抗原物质具有很强的吞噬功能,常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒,用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。

酸性磷酸酶的测定硝酸铅法偶氮法1非特异性酯酶的测定常用α-萘醋酸法2(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定01细胞毒作用测定02用IFN-γ激活小鼠巨噬细胞,观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。

(五)巨噬细胞促凝血活性测定激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子,加速正常血浆的凝固,为此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2混合液,加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中,移置37℃,即时记录血浆凝固时间。

反映机体免疫功能状态。01肿瘤、免疫缺陷病等疾病的诊断和疾病预后监测。02组织器官移植后对受者的细胞免疫学功能监测则有利于排斥反应的早期发现,以便及时采取有效措施。

03第三节免疫细胞功能检测的临床应用T细胞功能检测内容有哪些?什么是T细胞增殖试验的原理、刺激物及方法学?何谓T细胞介导的细胞毒试验的原理和方法学?何谓结核菌素皮肤试验?B细胞功能检测的方法学有哪些?何谓溶血空斑试验的原理和方法学?NK细胞活性测定的方法学有哪些?中性粒细胞功能检测方法学及相应原理。巨噬细胞功能检测方法学及相应原理。免疫细胞功能检测的临床应用有哪些?思考题重点免疫细胞功能检测试验名称Boyden小室常用于测定（)01白细胞吞噬功能02中性粒细胞趋化功能0