维生素C的发酵生产

湖北大学

发酵工程与设备课程设计

题目维生素C的发酵生产

专业年级2008级生物工程

学生姓名_______

学号

指导老师__________

2011年6月10日

目录

1前言----------------------------------------------------------1

维生素c的性质---------------------------------------------1

维生素c的功能与用途---------------------------------------1

维生素c的生产现状-----------------------------------------1

维生素C的研究发展------------------------------------------1

2.发酵机制

我国维生素C二步发酵法发酵机理

-----------------------------------------------------------------------------------2

3.发酵工艺及特点-----------------------------------------------3

二步发酵法---------------------------------------------------3

二步发酹法生产维生素C的工艺流程----------------------------4

3.2.1加热沉淀法------------------------------------------------------------6

3.2.2化学凝聚法------------------------------------------------------------6

4.菌种培养基及种子的扩大培养----------------------------------6

第一步发酵----------------------------------------------------6

4.1.1菌种------------------------------------------------------------------6

4.1.2一级种子扩大培养-------------------------------------------------------7

4.1.3第一步发酵培养--------------------------------------------------------7

第二步发酵----------------------------------------------------7

4.2.1菌种-----------------------------------------------------------------7

4.2.2二级种子扩大培养-----------------------------------------------------7

4.2.3第ZL步发-------------------------------------------------------7

5.发酵工艺中的部分设备----------------------------------------7

机械搅拌罐----------------------------------------------------7

气升式发酵罐--------------------------------------------------7

6.无菌空气制备系统---------------------------------------------9

发酵空气的标准------------------------------------------------9

空气预处理与设备----------------------------------------------9

空气过滤灭菌的工艺流程----------------------------------------9

7.部分工艺计算-------------------------------------------------10

物料衡算----------------------------------------------------10

每天发酵液体积------------------------------------------------10

发酵罐公称体积-----------------------------------------------10

种子罐容积和台数-------------------------------------------10

种子罐公称体积-----------------------------------------------10

发酵罐发酵过程中热效应计算-----------------------------------10

8.三废处理------------------------------------------------11

三废生物处理的目的-------------------------------------------11

废水处理方法-------------------------------------------------12

生物滤过法净化处理-------------------------------------------12

生物滤过池法的基本流程---------------------------------------13

9参考文献-------------------------------------------------14

维生素C的发酵生产

刖后

维生素C的性质

维生素C(VitaminC,AscorbicAcid)又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素。

化学性质分子式：C6H806；分子量：；酸性，具有较强的还原性，加热或在溶液中易敏化分解,在

减性条件下更易被氧化。

物理性质外观：无色晶体；熔点：190-192'C;沸点：(无)；紫外吸收最大值：245nm；荧光光谱:

激发波长一无nm,荧光波长一无nm；溶解性：水溶性维生素。

代谢食物中的维生素C被人体小肠上段吸收。一旦吸收,就分布到体内所有的水溶性结构中.正常

成人体内的维生素C代谢活性池中约有1500mg维生素C,最高储存峰值为3000mg维生素C。正常情

况下，维生素C绝大部分在体内经代谢分解成草酸或与硫酸结合生成抗坏血酸-2-硫酸由尿排出；另

一部分可直接由尿排出体外。

维生素C的功能与用途

狡原蛋白的合成需要维生素C参加，所以VC缺乏食用富含维生素C的食物可防晒.胶原蛋白不

能正常合成，导致细胞连接障碍。人体由细胞组成，细胞靠细胞间质把它们联系起来，细胞间质的美

健成分是胶原蛋白。胶原蛋白占身体蛋白质的1/3,生成结缔组织，构成身体骨架。如骨骼、血管、

韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑，并且有助于人体创伤的愈合。

坏血病血管壁的强度和VC有很大关系。微血管是所有血管中最细小的，管壁可能只有一个细胞的

厚度，其强度、弹性是由负责连接细胞具有胶泥作用的胶原蛋白所决定。当体内VC不足，微血管容

易破裂，血液流到邻近组织。这种情况在皮肤表面发生，则产生淤血、紫痕；在体内发生则引起疼痛

和关节涨痛。严重情况在胃、肠道、鼻、肾脏及骨膜下面均可有出血现象.乃至死亡。

牙龈萎缩、出血预防动脉硬化可促进胆固醇的排泄，防止胆固醇在动脉内壁沉积，甚至可以使沉积

的粥样斑块溶解。

抗氧化剂可以保护其它抗氧化剂，如维生素A、维生素E、不饱和脂肪酸，防止自由基对人体的伤

害。

治疗贫血使难以吸收利用的三价铁还原成二价铁,促进肠道对铁的吸收,提高肝脏对铁的利用率

有助丁治疔缺铁性贫血。

防癌丰富的胶原蛋白有助于防止癌细胞的扩散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害防

止细胞的变异；阻断亚硝酸盐和仲胺形成强致癌物亚硝胺。曾有人对因癌症死亡病人解剖发现病人体

为的VC含量几乎为零。

保护细胞、解毒，保护肝脏在人的生命活动中，保证细胞的完整性和代谢的正常进行至关重要。为

比,谷胱甘肽和酶起着重要作用。谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸组成的短肽，在体内有氧化

还原作用。它有两种存在形式，即氨化型和还原型，还原型对保证细胞膜的完整性起重要作用。VC

是一种强抗氨化剂，其本身被氧化，而使氯化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽,从而发挥抗氮化

作用。酶是生化反应的催化剂，有些酶需要有自由的筑基（-SH）才能保持活性。VC能够使双硫键

（-S-S）还原为-SH,从而提高相关酶的活性，发挥抗氧化的作用。从以上可知,只要VC充足，则

VC.谷胱甘肽、-SH形成有力的抗氧化组合拳,清除自由基，阻止脂类过氧化及某些化学物质的毒害

作用，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢。

提高人体的免疫力白细胞含有丰富的VC,当机体感染时白细胞内的VC急剧减少。VC可增强中性粒

细胞的趋化性和变形能力.提高杀菌能力。促进淋巴母细胞的生成，提高机体对外来和恶变细胞的识

别和杀灭。参与免疫球蛋白的合成。提高CI补体酯酶活性，增加补体CI的产生。促进干扰素的产生,

干扰病毒mRNA的转录,抑制病毒的增生。

提高机体的应急能力人体受到异常的刺激，如剧痛、寒冷、缺氧、精神强刺激.会引发抵御异常剌

激的紧张状态.该状态伴有一系列身休.包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增多.肾上

腺髓质所分泌的肾上腺素和去甲肾上腺素是有酪氨酸转化而来，在次过程需要VC的参与。

1.3国内外的生产现状目前，我国的二步发酵法与国外的莱氏法共存，各有优势，随

着对vc发酵工艺研究深入，将进一步提高底物浓度、降低生产成本和提高发酵收率。而

新二步发酵法和一步发酵法为以后的科研生产开辟了一条新的途径，但离实际应用尚有

距离，从基因工程的研究来看，不是短期可以奏效的，只有科研单位和工厂的合作，才

能及早实现其工业化。随着全球范围对Vc需求量的不断增长.其生产工艺也得到不断的

改进。Vc生产最早是使用莱氏法,此法早在30年代就研究成功。D-葡萄糖H2/cat高压

D-山梨醇黑醋菌[0]L-山梨糖CH3coeH3H2s04•S03双丙酮-1_-山梨糖Na0CINiS04双丙酮

-2-酮-L-古洛糖酸H+302-酮-L-古洛糖酸1化学转化维生素C。此法存在着工序繁多、劳

动、强度大等缺点。国外在此基础上已作改进,尤其是在装备工程上的优势，当前还用于

生产。但国内已采用我国自己发明的发醉法代替莱氏法生产Vc。发酵法生产Vc可以分

为发酵、提取和转化三大步骤。即先从D-山梨醇发酵,提取出Vc前体2-酮-L-古洛糖酸

（2-酮基古龙酸，1）再用化学法将1转化为Vuo国内外为提高Vc的质量和收率对发醉

法的生产工艺一直在进行不断的改进。

1.4维生素C的研究发展VC是我国自主知识产权开发的首批西药之一，也是我国最主

要的出口刨汇原料药之一。二步发酵法是我国VC生产的主要工艺方法，然而该法不能直

接以葡萄糖为发酵料，且涉及二步发酵三种菌，工序繁琐。采用基因工程等先进技术

选育直接以葡萄糖为发酵原料的优良菌株和优化发酵条件将是我国VC生产技术研究的

主要方向。

比外，目前世界上很多国家正尝试以真核生物为研究对象.利用它们合成VC的代谢途径开发更加环

保的生物合成方法。从我国的二步发酵法推广后逐步取代莱氏法这一过程可以预测，随着生物技术的

不断发展和更具优势的生物合成VC方法的不断涌现.生物法必将完全取代化学法在VC生产中的地

位。为了保持我国在世界VC生产上的优势地位，必须加强VC生产的基础研究工作。

2发酵机制（二步发酵法）

我国维生素C二步发酵法发电机理20世纪70年代初，中国科学院微生物研究所和北

京制药厂合作，研制成功了“二步发酵法”制备VC的新工艺。该法以生物氧化过程代

替莱氏路线中的部分纯化过程，简化了生产工艺，降低了生产成本，减少了“三废”污

染多年以来一直被国内厂家使用。二步发酵法生产VC可以分为发酵、提取和转化三大

步骤即D-山梨醇先经细菌氨化为L一山梨糖，再通过细菌发酵生成VC前体2-KLG,最

后用化学法将2-KLG转化为VCo在几十年的工艺发展中，二步发酵法工艺不断地得到了

改进。

混合发酵中大的和小菌的关系我国维生素C二步发酵法涉及小茵和大菌2个菌株。其中小菌为产

酸菌，但单独培养传代困难，且产酸能力很低;大菌不产酸，但可促进小菌生长和产酸，为小菌的

伴生菌。魏东芝等物提出大醯为小菌提供某种生长因子促进小菌生长的设想。冯树等〔川研究证实,

大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期;大菌的胞外液可促进小菌产酸,

表明大菌通过释放某些代谢活性物质促进小菌产酸,并已从大菌胞外液中分间出一种可促进小菌产

酸的蛋白。该活性蛋白的形成规律和作用机制尚在探索中。在混合发酵中，大菌不代谢L一山梨糖,

其I洲一山梨糖的消耗是小菌生长和代谢的结果。L一山梨糖在转化合成2一酮基一L一古龙酸的同

时也可形成其它副产物或代谢为c（无和践＜）［川。李强等报道［23］,该混合发酵体系中氮源代谢与

单一菌种发酵相比有其特殊性，尿素的加入有2个作用:作为生理喊性物质调节pH值和为菌体代谢

提供一部分氮源。巨大芽抱杆菌由营养体转变为芽抱，体系蛋白含量随发酵时间延长而不断增加。

体系中17种氨基酸按其变化规律分为3类，其变化规律与混菌的生长规律相吻合。

L一山梨糖代谢途径及酶学研究我国维生素C二步发酵中L一山梨糖的代谢途径尚无报道。

有关的酶学研究进行得很少。蒋宇扬等从维生素c生产菌中分离出2一酮基一L一占龙酸还

原酶，井对其性质进行了研究。该酶存在于小菌胞质中，分子量为90KDa,由2个分别为53K〕

和32KI）a的亚基组成。在整个发醉过程中其活性和比活与生产菌的生长保持同步，其合成不

受L一山梨糖和ZK6A的诱导，为小菌的组成酶。赵巍等已得到2一酮基一L一古龙酸还原酶

的基因片段并对其进行了克隆。

单菌发酵L一山梨搐生成ZKGA的研究中国科学院沈阳应用生态所焦螭、王书锦等近年致

力于vc二步发酵法第二步单菌发酵L一山梨糖生成ZKGA的研究。他们采用高效快速分离筋

选新体系，从103个样品中分离筛选到J26,91—2,91—4等多株可单独利用L一山梨糖

产ZKGA的新菌株。初步发酵实验表明:J26经10批次发酵平均产ZKGA达57以L,转化率

达尔91-2,91-4菌株的摇瓶发酵实验的产酸■分别达到45以L和29酬L,转化率分别达

到52%和34%。

3发酵工艺及特点

二步发酵法20世纪70年代初，中国科学院微生物研究所和北京制药厂合作，研制成

功了“二步发酵法”制备VC的新工艺。该法以生物氧化过程代替莱氏路线中的部分纯化

过程，简化了生产工艺，降低了生产成本，减少了“三废”污染多年以来一直被国内厂

家使用。二步发酵法生产VC可以分为发酵、提取和转化三大步骤即D-山梨醇先经细菌

氧化为L一山梨糖，再通过细菌发酵生成VC前体2-KLG,最后用化学法将2-KLG转化为

VCo在几十年的工艺发展中，二步发酵法工艺不断地得到了改进。

二步发酵法生产维生素C的工艺流程

3.2.1加热沉淀法加热沉淀法是2-KLG分离提纯的传统工艺，分离手段较为落后。此工艺通用氢型

树脂，调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失，且发

酵液直接通过树脂柱，造成树脂表面污染，降低树脂的交换容量和收率。两次通过树脂柱带进了大量

水分，也增大了浓缩耗能。

3.2.2化学凝聚法化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质，避免了

加热沉淀时有效成分的损失。季光辉等采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理，使2-KLG的滤液质

量提高，提取前步收率提高5.2,VC总收率提高2.5以上。陈雷等以壳聚糖为主凝剂，聚丙烯酰胺

为助凝剂，通过化学凝聚法除蛋白工艺，提取收率由原来的76提高到82.古龙酸优级品率由原来的

35提高到60,成本比原来降低20。但是，化学凝聚法也存在不足，主要表现在处理后的发酵液离心

后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白，如发酵液染菌则处理的效果更不明显,上清液浑浊，严

重影响产品的质量和收率。此外，所用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。

3.2.3超滤超滤是一种新兴的膜处理技术，此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优

点.因此在2-KLG的分离提纯中的应用日益广泛。此法与加热沉淀法不同的是，可在常温下操作，可

减少有效成分的损失；在用膜除蛋白的过程中，无任何新的化学物质加入，可减少对树脂的污染和损

耗，降低酸碱用量，减少三废排放。与化学凝聚法不同的是，在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的

处理效果。我国的东北制药厂1995年从丹麦引进目前全国最大膜面积的平板超滤装置后，2-KLG的

分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元.其收率和生产的自动化、连续化程度也明显提

高。随着新型膜材料技术的开发，如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用.超滤法的应用效果会有进一步的提

高。同时，国内外正在探索反渗透、纳滤等后序处理新工艺的应用，以完善工艺联结。

4菌种的制备及种子的扩大培养(此部分介绍实验室种子的制备、种子罐和

子的制备工艺及技术参数要求)

第一步发酵

4.1.1菌种一步发酵中所用菌种为生黑葡萄糖酸杆菌(Gluconobactermelagenus),简称黑醋菌。

最常用的生产菌株为R—30,其主要特征是：细胞椭圆至短杆状，革兰氏染色阳性，无芽泡大小为

-umxo端生草根鞭毛运动，菌落边缘整介，微显浅褐色。生长最适温度为34'C±「C,氧化D-山

梨醉的发酵收率可达98%以上。

4.1.2一级种子扩大培养种子培养基成分为：山梨醇20%,酵母育%,碳酸钙乳无机盐溶液％。

其中，无机盐溶液的组成为：MgS04-7H201.25g/100mL,(NH4)H2P047.5g/100mL,KH2P045g/

100ml,K2S041.25g/6.7,121℃,30min灭菌。

4.1.3第一步发酵培养发酵液培养基成分为：酵母膏％,碳酸钙%,玉米浆％,复合维生素B%

山梨醉浓度视需要而定。在发酹过程中，控制发醉温度(34±1)初始〜。该氧化反应的耗氧量

较大，所以通气比要求1：1VVM以上。即使在通气量较大，且搅拌转速较高的条件下，发酵至4h后溶

解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。直到10h左右才逐渐回升。当溶解氧浓度回复至最高点，成水平

直线时，表示该反应已达终点。D~山梨醇转化为L-山梨糖的生物转化率达98*以上。发酵液经低温

60℃灭菌20min,冷却至30℃,作为第二步发酵的原料。

第二步发酵法

4.2.1菌种第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。小菌为氧化葡萄糖酸杆菌

(GluconobacterOxydans)，大茵可采用巨大芽胞杆菌(Bacillusmegateriam)，称2980菌，或蜻

状芽胞杆菌(BaciIluscereus)，称152菌，或浸麻芽胞杆菌(BaciIIusmacerans)，称169菌。也

可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。但工业上使用最多的是2980及152菌混合菌。

氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：细胞椭圆至短杆状，革兰氏染色阳性，无芽胞。30C培养2d

后大小为(〜)pmX(〜)um,单个或成对排列。在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醉培养基上生

长良好。

4.2.2二级种子扩大培养种子培养基成分为：酵母膏取牛肉膏队玉米浆乳蛋白豚乳尿素%,山

梨糖以另加某些无机盐。PH6.7,121°C,30min灭菌。

4.2.3第二步发酵培养发酵液培养成分为：玉米浆K尿素十无机盐及山梨糖。第二步发酵为混合

菌种发酵。由于大、小菌两者的最适培养条件是不同的，所以操作适宜条件是兼顾大、小菌两者的条

件。通常操作温度为3（rc；初始pH控制在左右。该反应虽属氧化反应，但对氮的消耗并不很大。气

升式发酵罐非常适合该发酵过程。溶氮浓度在20爷即可。

•14梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。间歇发酵时初始山梨糖浓度超过80g/L,会对产物产生抑

制［15］。所以要取得最高浓度2KGA.需采用高浓度山梨糖流加发酵的方式。若采用建立在数学模型

基础上的流加控制策略.课获得高浓度的2KGA.二步收率可达83$［16］。

5.发酵工艺中的部分设备

机械搅拌罐第一步发醉采用机械搅拌发酵罐（图5）。机械搅拌通风发醉罐是利用机械

搅拌器的作用，使空气和醪液充分混合促使氧在醪液中溶解，以保证供给微生物生长^

殖、代谢所需要的氧气。

气升式发酵罐第二步发酵采用气升式发酵罐（图6）o在反应器内没有搅拌器，其中

央有一个导流筒，将发酵液分为上升区（导流筒内）和下降区（导流筒外），在上升区

的下部安装了空气喷嘴，或环型空气分布管，空气分布管的下方有许多喷孔。反应溶液

分布均匀.基质和溶氧均匀分散.使基质在发酵罐内各处的浓度均匀.溶解氧恒定。

图5机械搅拌发酵维

图6气（带）升式发酵罐

6.无菌空气制备系统

微生物在生产过程中需要氧气，因此需要通入空气。然而空气是氧气、二氧化碳、氮气等的混合物

其口还有水汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。这就需要对空气严格灭菌，达到无菌状态,

才能使用。在发酵工业中，大多才用过滤介质灭菌的方法制备无菌空气。

发酵空气的标准

发酵需要连续的、一定流量的压缩无菌空气。空气流量1VVM,单位时间（min）单位发酵液体积（m3）

内通入的标准状态下的空气体积（m3）1一般在，压强为，克服下游阻力。空气质量要求相对湿度小于

70%,温度比培养温度高10-30"C,洁净度100级，或失败率1/1000。

空气预处理与设备

（1）采风塔在工厂的上风头，高度一般在10m左右，设计流速8m/s。可建在高压机房的屋顶上。

（2）粗过滤器安装在空压机吸入口前，前置过滤器。作用是截留空气中较大的灰尘，保护压缩机

减轻总过滤器的负担，也能起到一定的除菌作用。介质为泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式），流

速。要求是阻力小，灰容量大。

（3）空气压缩机作用是提供空气流动的动力。常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。

（4）空气储罐消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。螺杆式和涡轮式空压机提供均匀连续空

气可省去。设置在空压站附近。

（5）冷却器空气压缩机出口气温一般在1209.必须冷却。在潮湿季节，除湿。空气冷却器的传

热系数为105W/（m2•℃）.采用双程或四程结构，两级串联使用.第一级循环水冷却，第二级低温水（9℃）

冷却。设置在发酵车间外。压缩空气每经过1m管道，温度下降。

空气过滤灭菌的工艺流程

图7空气过滤灭菌的工艺流程

7.部分工艺计算

物料衡算根据质量守恒定律,以生产过程或生产单元设备为研究对象.对其讲出口

处进行定量计算，称为物料衡算。通过物料衡算可以计算原料与产品间的定量转变关系，

以及计算各种原料的消耗量，各种中间产品、副产品的产量、损耗量及组成。

物料衡算的基础：物料衡算的基础是物质的质量守恒定律，即进入一个系统的全部物料量

必等于离开系统的全部物料量，再加上过程中的损失量和在系统中的积累量。

EG1=IG2+EG3+EG4

ZG1:—输人物料量总和；ZG2:——输出物料量总和；ZG3:——物料损失量总和；

ZG4:——物料积累量总和。

当系统内物料积累量为零时，上式可以写成：ZG1=ZG2+ZG3

物料衡算是所有工艺计算的基础，通过物料衡算可确定设备容积、台数、主要尺寸，同

时可进行热量衡算、管路尺寸计算等。

物料衡算的基准：

⑴对于间歇式操作的过程，常采用一批原料为基准进行计算。

（2）对于注续式操作的过程，可以采用单位时间产品数量或原料量为基准进行计算。物料衡

算的结果应列成原材料消耗定额及消耗量表。

消耗定额是指每吨产品或以一定量的产品（如每千克针剂、每万片药片等）所消耗的

原材料量；而消耗量是指以每年或每日等时间所消耗的原材料量。

制剂车间的消耗定额及消耗量计算时应把原料、辅料及主要包装材料一起算入。

例：维生素C的二步发酵收率为23$,粗维生素C的利用率为80乳成品包装是的损耗为2$,试计算

生产1000吨维生素C所消耗的原材料

解：物料衡算

成品维生素C:1000吨

维生素C:1000+(1-2%)=1020吨

粗维生素C:1020・80%=1275吨

原材料：1275+83$=1536吨

每天发酵液体积由年产量决定每天放罐发酵液体积，在发醉工段，每天所需要的放罐

发酵液体积Vd可按下式计算：

M——所设计的年产量.t/a;

Uq----成品的纯度，mg/mg;

n----年工作日，d/a;

T1一一提炼总收率，

发酵罐公称体积

Vd——每天所需发酵液体积.m3/d:

nd——每天放罐罐数.1/d;

L一发酵罐装料系数.按品种不同,可取70k9(设。

种子罐容积和台数

种子罐的公称容积应根据接种比，培养过程中液体损失率和种子罐的装料系数来让

算

发酵罐发酵过程中的热效应计算

Q=QF-VL

Q——发酵罐的热效应.kJ/h;

OF——单位休积发酵液所产生的热量，又称为发酵热，kJ/（m3•h）；

VL——发酵罐内发酵液体积,m3。

8.三废处理

三废生物处理的目的

1998年我国食品发酵企业已达7万多个，总产值达5900亿元，产值在各产业部门中已跃居第一位,

成为国民经济的主要支柱产业。然而，随着这些工业的飞速发展