2027版高考生物总复习精练第二十四章 基因工程

第二十四章基因工程生物学新高考适用目录CONTENTS第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取第2节PCR和电泳

PCR引物设计、选择及应用第3节基因工程和蛋白质工程

基因编辑技术微专题微专题第1节重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取五年高考1.★★(2024安徽,14,3分)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是()A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNAC.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质D

解析沸水浴条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但

无法检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D错误。2.★★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被

酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是

()A.限制酶失活,更换新的限制酶B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNAD.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶

B

解析限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A正确;酶切条件不

合适通常会使切割效果下降,此时应有部分DNA被酶切,即使酶切条件导致限制酶失

活,而使DNA完全没有被酶切,也不能通过改变“酶的用量”来调整反应,B错误;质粒

DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,因此应更换为正常质

粒DNA,C正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制

酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D正确。3.★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]

获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建

了基因表达载体。下列叙述错误的是

()A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶

B

解析引物(是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸,扩增获得

的子链中包含了引物序列)引导子链DNA从5'到3'的方向合成,分析题图扩增获得的

DNA片段可知,其中一个引物(引物2)序列为5'-TGCGCAGT-3',A正确。结合限制酶的

切割位点,可知步骤①选用的限制酶是NheⅠ和CfoⅠ,具体过程如解析图,B错误。

根据载体的结构可分为环状DNA(如质粒)和线性DNA,使用NheⅠ、CfoⅠ两种酶

切环状DNA,可获得2个片段;使用NheⅠ、CfoⅠ两种酶切线性DNA,可获得更多片段,

故用步骤①的酶对载体切割之后至少获得了2个片段,C正确。酶切后形成的是DNA黏

性末端,E.coliDNA连接酶和T4DNA连接酶均可连接黏性末端,D正确。4.★★★[2022福建,21节选]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细

胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨

噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:(一)基因工程抗原的制备

(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA

聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的

延伸方向是__________(填“5'→3'”或“3'→5'”)。(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶

切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组

DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是_______________

__________________________________________________________________________

________________________________________________。(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)

组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序正向连接的重

5'→3'

解析

(1)PCR扩增过程中,引物链的延伸方向为5'→3'。(2)两种酶虽然能切出相同的

黏性末端,但正向连接的重组DNA,限制酶的识别序列没有变,仍能用原来的两种酶进

行酶切;反向连接的重组DNA,不存在XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶的识别序列,无法再进

行酶切。三年模拟5.★★(2026届广西名校联盟联考)某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与

鉴定”实验。操作流程如下:①组织捣碎后加入研磨液充分研磨;②过滤取滤液,置于4℃冰箱静置分层;③取上清液加入等体积预冷的95%酒精;④离心后收集沉淀物;⑤取部

分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是

()A.步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶,所以冷酒精可使DNA快速析出B.步骤⑤鉴定时,直接取④离心收集的沉淀物与二苯胺混合,室温下放置观察颜色变化C.若利用提取物进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,迁移距离越大的DNA片段相对分子

质量越大D.步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中,需用高浓度NaCl溶液重新溶解

A

解析DNA不溶于酒精,而细胞中的某些蛋白质可溶于酒精,步骤③中利用了蛋白质与

DNA在95%的冷酒精中溶解度的差异析出了DNA,A正确;④离心收集的沉淀物是

DNA,需溶解在2mol/L的NaCl溶液中再与二苯胺试剂混合,沸水浴加热才能呈现蓝色,

B错误;其他条件相同的条件下,DNA片段在琼脂糖凝胶中的迁移速率与相对分子质量

呈负相关,即相对分子质量越小的DNA片段,迁移距离越大,C错误;步骤②中滤液静置

分层后,DNA主要存在于上清液中,而非沉淀,无需用高浓度NaCl溶液重新溶解,D错误。6.★★(2025届河北衡水三模)下列关于基因工程工具酶的叙述,正确的是

()A.大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成B.限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键C.DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶D.T4DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端

A

解析限制酶通常识别双链DNA的特定核苷酸序列,大多数限制酶的识别序列由6个

核苷酸组成,A正确。限制酶切割的是磷酸二酯键,B错误。限制酶可切割磷酸二酯键,

DNA连接酶可连接DNA片段间的磷酸二酯键,限制酶和DNA连接酶是构建重组DNA

的关键酶,DNA聚合酶可催化单个脱氧核苷酸连接到核苷酸链上,在DNA复制时可发

挥作用,C错误。T4DNA连接酶可连接黏性末端和平末端,D错误。7.★★(2025届广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是

6种不同限制酶的识别序列和切割位点,下列叙述错误的是()A.BamHⅠ和BsrGⅠ切割位点不同,但形成的黏性末端是相同的B.与EcoRⅠ相比,HhaⅠ识别序列较短,该序列在DNA中出现的概率高C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接D.图中限制酶识别序列旋转180°后与旋转前重合

A

解析

BamHⅠ和BsrGⅠ的切割位点不同,切割后形成的黏性末端分别为5'-GATC-3'、

5'-GTAC-3',黏性末端也不同,A错误;越短的核苷酸序列在DNA分子中出现的概率越高,

EcoRⅠ与HhaⅠ的识别序列分别为5'-GAATTC-3'和5'-GCGC-3',HhaⅠ识别序列在

DNA中出现的概率高,B正确;BamHⅠ切割产生的黏性末端与MboⅠ切割产生的黏性末

端相同,均为5'-GATC-3',故二者切割DNA得到的黏性末端可以拼接,C正确;图中限制酶

识别序列旋转180°,其碱基排列会和旋转前一样(重合),D正确。知识拓展基因工程中使用的限制酶的识别序列一般具有回文结构(180°旋转对称)。

在DNA双链中,回文结构指的是DNA一条链从左至右读过去跟另一条链从右至左读过

来是一样的碱基顺序,即两条链从5'往3'读,碱基序列是一样的。如BamHⅠ的识别序列

的一条链是5'-GGATCC-3',其互补链的识别序列从5'端开始读也是GGATCC。8.★★★(2025届重庆一中月考)一般情况下,限制酶的识别序列越长,在DNA中出现的

概率越低,切割频率越小。限制酶K的识别序列为5'-A↓ATATT-3',限制酶L识别序列

为5'-GC↓GC-3'。下列叙述正确的是

()A.若DNA中碱基随机分布,限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K

的16倍B.限制酶K的识别序列更长,故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶LC.限制酶K的识别序列富含A—T碱基对,表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋

能力D.限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段

A

解析DNA的碱基有A、T、C、G共4种,限制酶L的识别序列为5'-GC↓GC-3',共4个碱

基,其识别序列理论上每44个碱基对出现一次,概率为1/44;限制酶K的识别序列为5'-A↓

ATATT-3',共6个碱基,其识别序列理论上每46个碱基对出现一次,概率为1/46;即限制酶L

的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的1/44÷1/46=16倍,A正确。一般情况

下,识别序列越长,在DNA中出现的概率越低,切割频率越小,虽然限制酶K的识别序列

更长,但是在某些DNA中也可能出现限制酶K识别序列较多,切割DNA频率较高的情况,

B错误。限制酶的切割活性依赖于其特定的空间结构等,而不是依赖于DNA双链的局

部解旋能力,C错误。限制酶K切割产生黏性末端,限制酶L切割产生平末端,两者切割后

产生的片段无法被T4DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段,D错误。9.★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特

性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制

酶的切割位点如图所示。

回答下列问题:(1)常用的DNA连接酶有___________________和T4DNA连接酶,图中________________

酶切割后的DNA片段用T4DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。

SmaⅠ和EcoRⅤ

E.coliDNA连接酶

(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是_______________。(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可

以保证质粒在受体细胞中__________;质粒DNA分子上有一至多个_________________,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的___________基因(如某种抗生

素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片

段,是_______________识别和结合的部位,能驱动_______过程。转录

RNA聚合酶

标记

限制酶的切割位点复制

磷酸二酯键

解析

(1)限制酶EcoRⅠ和PstⅠ切割形成的是黏性末端,限制酶SmaⅠ和EcoRⅤ切割形

成的是平末端,E.coliDNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率远远低于T4DNA

连接酶。(2)DNA连接酶可使两个DNA片段间形成磷酸二酯键而连接在一起。(3)质粒

是小型环状的DNA分子,常作为基因表达的载体,质粒上含有复制原点,能保证质粒在

受体细胞中自我复制;质粒DNA分子上有一个至多个限制性内切核酸酶的酶切位点,便

于目的基因插入其中;质粒上常有特殊的标记基因,便于重组DNA分子的筛选。(4)启

动子是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的上游,它通过与RNA聚合酶识别和结

合,驱动基因转录出mRNA。第2节PCR和电泳五年高考1.★(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。

为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链

不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的

()A.1'-碱基B.2'-氢

C.3'-羟基D.5'-磷酸基团

C

解析DNA聚合酶催化游离核苷酸加到已有的核酸片段3'端的羟基上,形成磷酸二酯

键,如果保护底物中脱氧核糖结构上的3'-羟基,使其无法参与反应,那么DNA聚合酶就

不能继续催化下一个脱氧核苷酸的加入,DNA链也就不再继续延伸,C正确。2.★★(2024黑吉辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正

确的是

()A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来

A

解析在琼脂糖凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度有关,一般而言,对于较大的

DNA片段,需要选择较低浓度的凝胶,对于较小的DNA片段,需要选择较高浓度的凝胶,

A正确;凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示电泳的前沿,而非指示DNA的具体位置,

B错误;DNA分子具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团可以带上正电荷或负电

荷,在电场的作用下,这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动,故在同一电场

作用下,DNA片段不一定向负极迁移,一般情况下,DNA片段越长移动速率越慢,C错误;

凝胶中的DNA分子通过染色,可在波长为300nm的紫外灯下被检测出来,D错误。3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗

提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是

()A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNAD.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA

C

解析为避免外源DNA等因素的污染,PCR实验时使用的微量离心管、枪头和蒸馏水

等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌处理,但移液器不需要,A错误;在将扩增得到的PCR

产物进行凝胶电泳时,应先加样,然后接通电源,B错误;鉴定DNA时,需要把白色丝状物

溶解在2mol·L-1的NaCl溶液中,再加入二苯胺试剂进行沸水浴,D错误。4.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品

种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如

图所示。下列叙述正确的是

()A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市

B

解析94℃预变性可使模板DNA解旋为单链,72℃延伸过程中才会使4种脱氧核苷酸

在耐高温的DNA聚合酶的催化作用下合成子链,A错误;由于耐高温的DNA聚合酶只能

催化单个的脱氧核苷酸添加到已有的核酸片段(如引物)的3'端,不能从头合成DNA,故

延伸过程中需要引物参与,C错误;为防基因污染,确保安全,我国制定了相关法规和政策

进行依法监管,转基因品种需经国家农业转基因生物安全委员会(评价机构)评价安全

后才可推广上市,D错误。5.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果

如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分

别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产

物。下列叙述错误的是

()A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷

C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物

D

解析配制琼脂糖凝胶时应选用适当的缓冲溶液,从而为核酸分子提供适合的缓冲环

境和离子条件,以使核酸分子在电场作用下能在凝胶中移动,A正确;分析电泳图示,加样

孔在电极的阴极(-)一侧,经过电泳后,所有DNA分子均向电极的阳极(+)方向移动,说明

在该实验条件下,DNA分子均带负电荷,B正确;电泳中,DNA分子的迁移速率与分子大

小、电荷的多少等多种因素有关,虽然甲、乙电泳条带位置基本相同,但影响DNA分子

迁移速率的因素有很多,因此甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同,C正确;

甲只有限制酶R的一个酶切位点,若被酶R完全酶切,可得到2种DNA片段(2个条带),这

两个条带的碱基数量比甲少,电泳时迁移的距离要比甲更远,因此,据图推测,样品4才是

甲被酶R完全酶切后的产物,D错误。6.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的

基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证

重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问

题:

(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是___________,而PCR过程中解开双链的方法是___________。(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有____________________

_______。(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是____________

___________________________________;②无扩增产物,原因是_____________________

_________________;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是_____________

__________________________________________。质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段

目的基因、2互补的碱基序列

P0不含与引物1和引物(或答:鉴定反应体系是否有模板污染)

作为对照磷酸

引物、脱氧核苷三高温变性

解旋酶

管号①②③④⑤⑥模板无P0PX无P0PX引物对引物1和引物2引物3和引物4(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果_________

_________________________________________________________________________

______。活性

X,催化相应底物(反应物)的反应,检测是否有产物生成。若有产物生成,则证明酶X有提取酶解析

(1)在细胞中,DNA复制时依靠解旋酶将DNA双螺旋的两条链解开,而PCR过程

中依靠高温变性解开DNA双链。(2)PCR的反应体系中,4种脱氧核苷三磷酸为合成

DNA子链的原料,引物与模板链结合后,DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核

苷酸,因此因反应消耗而浓度减少的有引物和脱氧核苷三磷酸。(3)实验中,①④均无模

板,作为空白对照,以鉴定反应体系是否有模板污染。②模板为P0,不含能与引物1和引物2互补配对的碱基序列,故无扩增产物。③、⑤、⑥的模板及扩增产物示意图如图所示:

(4)实验思路:将大肠杆菌培养后,提取酶X,在适宜条件下,加入酶X的底物,检测产物的

生成情况。预期结果:若有产物生成,则证明酶X有活性。三年模拟7.★★(2026届四川成都七中月考)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确

的是()A.PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的B.用于PCR扩增的TaqDNA聚合酶是一种耐高温的逆转录酶C.PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸D.扩增循环按顺序一般分复性→变性→延伸三步

A

解析PCR扩增中双链DNA通过加热(90℃以上)解旋,无需解旋酶,A正确;TaqDNA聚

合酶是耐高温的DNA聚合酶,不是逆转录酶,B错误;PCR反应体系中dNTP既提供原料又提供子链延伸的能量,C错误;PCR每次循环一般可以分为变性→复性→延伸三步,D错误。8.★★(2026届广东部分学校联考)进行PCR时,若设计的引物过短,则会出现对应不良情

况。下列不属于对应不良情况的是

()A.引物与特异性位点结合的正确率降低B.PCR后出现多条非特异性子链C.引物与模板链结合的稳定性增强D.引物之间发生配对的概率增大

C

解析引物过短,会导致引物特异性差,易与非目标序列结合,结合正确率降低,PCR后

易出现多条非特异性子链,A、B属于对应不良情况;引物与模板的结合本质是碱基互

补配对,一般引物越长,互补碱基对越多,形成的氢键就越多,结合就越稳定,引物过短,互

补碱基对少,结合稳定性一般较弱,C不属于对应不良情况;引物过短,引物之间更易发生

配对,并经TaqDNA聚合酶延伸后形成引物二聚体,D属于对应不良情况。9.★★★(2026届湖北华大新高考联盟质量测评)研究者分别选取小麦感病品系和抗病

品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR扩增,泳道1、2分别对应染色体

1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基

因缺失一部分碱基序列造成的,图2为感病基因序列示意图。下列分析错误的是

()A.在PCR扩增时,所用引物越短,引物特异性越低B.两个PCR产物相对分子质量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变

大C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果答案

D解析PCR中,引物是与模板DNA特定序列结合的短单链核酸,一般引物越短,其与非目

标序列结合的可能性就越大,因此特异性越低,A正确;电泳时,DNA分子在凝胶中因相

对分子质量差异而迁移速率不同,相对分子质量接近的DNA分子,在电场中移动速率相

近,适当延长电泳时间,会让这种速率差异带来的距离差更明显,两个条带的距离就会变

大,B正确;根据题意知,抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,碱基序

列发生改变,属于基因突变,再结合图1,对染色体1相关基因进行PCR及电泳检测,抗病

品系和感病品系结果相同,对染色体2相关基因进行PCR及电泳检测,抗病品系和感病

品系结果不同,推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突

变,C正确;引物需要与待扩增片段模板链的3'端结合且延伸方向相反,图2中可选的引物组合有引物1和引物2、引物1和引物3,图1中泳道2,感病品系有条带,抗病品系无条带,

说明选用的引物组合无法扩增抗病基因(抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基

序列造成的),图2中引物3与缺失片段互补配对,即抗病基因无引物3的结合序列,选用引

物1和引物3无法扩增出抗病基因,故推知选用的引物是引物1和引物3,D错误。10.★★★(2026届湖南部分学校联考,改编)果荚开裂并释放种子,是植物繁衍后代的重

要途径。拟南芥是自花传粉植物,研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。研究者通过筛选拟南芥外源DNA片段插入突变体库,获得果荚不开裂的突变体甲。检

测发现突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基

因。研究者利用不同的引物对,分别进行PCR,检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型,

结果如图1,验证了上述推测。在图2中已标出引物3的位置,选出引物1、2的位置,引物1

为______,引物2为______(从A→E中选)。

D

B

解析突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基

因。野生型拟南芥基因型为MM,突变体甲基因型为mm。先分析检测M基因的引物:图

2中除引物3,引物B、引物E与M基因的相应片段结合,可用于扩增M基因的相应片段,其

中引物B与引物3分别与M基因两侧的链结合,且延伸方向相反,可扩增出两条引物之间

的序列。分析检测m基因的引物,基因m由M基因中插入X片段得到,如图2。引物3与引

物C、D可用于检测基因m,由图1知,突变体甲的扩增条带比野生型距离点样孔更远,说

明其相对分子质量更小,故选用的引物组合是引物3与引物D。微专题PCR引物设计、选择及应用五年高考1.★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染

病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答

过程中发挥重要作用。回答下列问题:(1)制备特定抗原①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括

目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和_____________________等;为确

定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物___________对待测

质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为________bp。

782

P1和P3

终止子(或复制原点)

②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合

成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是_____________

__________________________________________________________________________

______________(答出两点即可)。分泌到细胞外

达(基因A突变/修饰等);蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,不能基因A未表(2)制备抗蛋白A单克隆抗体用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合

的常用方法有________________________________________(答出一种即可)。选择培

养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和____________,多次筛选获得足够数量的能分泌

所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲

猪瘟的早期诊断。抗体检测

PEG融合法(或电融合法/灭活病毒诱导法)

解析

(1)①PCR时选用的两种引物应该方向相反,分析题图,P3是唯一一个与P1和P2方

向相反的引物,故必选P3;PCR的目的是确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,P3

和P2分别与基因A两端互补配对,若选该对引物进行扩增,无论基因A插入质粒方向是

否正确都可以扩增出片段(基因A),不符合要求;P1与质粒一段序列互补配对,P3与基因

A的一端互补配对,选P1和P3为引物,扩增时,若基因A未插入质粒,则不能扩增出相应片

段;若基因A插入质粒的方向错误,也不能扩增出相应片段,故应选P1和P3对待测质粒进

行PCR扩增。预期扩增的片段包括质粒的一段序列(200bp)和基因A(582bp),故扩增片

段大小为200bp+582bp=782bp。②上清液中检测到蛋白A的条件有:基因A正常表达;

蛋白A可分泌到细胞外。故上清液中无蛋白A,可能的原因是基因A未表达(基因A突变/修饰等);蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,不能分泌到细胞

外。(2)诱导动物细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等。对

经选择培养所得的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,经多次筛选,就可获得足够

数量的能分泌所需抗体的细胞。2.★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重

组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:图1(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有____________,模板和引物扩增程序中最主要的不同是_________。(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用_______。

图2A.ATGGTG------CAACCAC.GACGAG------CTGCAGB.TGGTTG------CACCATD.CTGCAG------CTCGTC(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于

转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有____________

______________________。切核酸酶、DNA连接酶

限制性内

CD

退火温度

(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有________。A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F

和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可

以舍弃的质粒有__________。

P3、P4

ABC

(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是

_____________________________________________________。电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度,不能呈现碱基序列

解析

(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有:模板

分别是片段F1、片段F2,引物分别是F1-R和F1-F、F2-R和F2-F;扩增程序中依据不同引

物设置不同的退火温度是最重要的环节,恰当地选择退火温度,尽量避免引物与模板的

非特异性结合,以保证目的产物的有效扩增。(2)由题中信息,画出F1与F2片段相接的序

列如图所示:

F2-F和F1-R应与F1片段的下游和F2片段的上游序列(F1与F2片段相接处)相同或互

补,C、D所给序列符合要求;而A项序列左右两端分别与F1片段上游序列和F2片段下游序列相同,B项序列左右两端分别与F2片段下游序列和F1片段上游序列互补,故A、B不

符合要求。(3)重组酶可以依据PCR扩增序列和线性载体两端的同源序列进行同源重组,不需要使用限制酶和DNA连接酶构建基因表达载体。(4)该过程的目的不是计数,

所以无需控制每个平板30~300个菌落,A错误。涂布平板时,培养基已凝固,不会烫死细

菌;抗性平板上未长出菌落,常见原因有未能有效实现重组质粒构建或未能进行有效转

化,B错误。含有抗生素的培养基可筛选出成功转化的大肠杆菌,不会出现大量杂菌形

成的菌落,C错误。单菌落一般是由单个微生物繁殖形成的纯培养物,在抗性平板上长

出的单菌落一般无需进一步划线纯化,D正确。(5)EGFP长度为720bp,AnB1长度为390bp,二者的总长度为720bp+390bp=1110bp,用引物F1-F和F2-R进行PCR扩增,其长度接

近P1、P2的扩增产物,根据图3中结果判断,可以舍弃的质粒有P3(无目的片段)、P4(产物片段大小不符)。(6)电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大致长度,无法显示

精准的DNA碱基数量,也不能呈现DNA碱基序列,因此对于PCR产物电泳结果符合预期

的质粒,通常需进一步通过基因测序确认。三年模拟3.★★★(2026届湖北荆州开学考)增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA序列,

现用PCR扩增增强子和Bt基因,然后重叠延伸使两片段融合,以实现对Bt基因表达的调

控,如图所示。下列叙述正确的是

()A.增强子中含多个起始密码子以促进基因转录B.引物B、C的序列需一致以促进两片段融合C.DNA单链B、C混合后才能延伸出融合片段D.为获得大量融合片段可用引物A、D扩增融合片段

D

解析起始密码子位于mRNA上,增强子是DNA序列,不含起始密码子,A错误;引物B、

C5'端部分片段碱基序列需互补,这样才能使扩增出的增强子和Bt基因片段在混合后通

过部分片段碱基互补配对,进而延伸融合,B错误;DNA分子延伸过程中,子链延伸方向

是5'→3',即从子链的3'端添加脱氧核苷酸进行延伸,故DNA单链A、D混合后才能延伸

出融合片段(可为子链延伸提供3'端),C错误;融合片段的两端分别是引物A和引物D对

应的序列,且引物A和引物D延伸方向相反,所以为获得大量融合片段可用引物A、D进

行PCR扩增,D正确。4.★★★(2025届山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的

技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR

技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如图所示,相关叙述正确的是

()A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3B.过程③中复性是在72℃左右使两种引物与模板链结合C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列

C

解析PCR时会扩增两引物间的片段,引物2、3和引物1、4可扩增的片段,如图:

过程③PCR后获得未知序列,故过程②中选用的引物是引物1、4,A错误;PCR过程中,复

性的温度为50℃左右,而72℃左右是延伸的温度,B错误;DNA聚合酶只能从引物的3'端

开始连接脱氧核苷酸,C正确;PCR第三轮循环才能获得两条链等长的未知序列,D错误。5.★★★(2026届辽宁七校协作体期初)雌激素类物质污染会通过食物链影响人体健康

和生态安全。科研人员欲将斑马鱼的vtg基因(图1)插入Luc基因载体(图2),形成vtg-Luc

融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。Luc表示萤火虫荧光素酶基因。(注:Luc基因

缺乏启动子序列,vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因,

AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、BclⅠ为限制酶,

→表示转录方向)(1)基因工程的核心步骤是_____________________。为使vtg基因与Luc基因载体正向

连接且降低“空载”概率,可选用限制酶______________________双酶切Luc基因载体。(2)通过PCR获取vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息,推测引物1包含的

碱基序列为_______。A.5'-GAATTCAACTAT-3'B.5'-GAATTCTTGATA-3'C.5'-GATCTTGATA-3'D.5'-AAGCTTAACTAT-3'(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉

A

EcoRⅠ、HindⅢ

构建基因表达载体

素、四环素的培养基中培养,_______(选填“能”或“不能”)在含有氨苄青霉素的培

养基中生长但_________(选填“能”或“不能”)在含有四环素的培养基中生长的大肠

杆菌即为目的菌。(4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子,E

蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是_______________。Luc基因的表达

产物萤火虫荧光素酶,可以催化荧光素氧化产生荧光。斑马鱼的vtg基因在正常情况下

不表达,当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋

白。在水样中添加荧光素后,Luc催化其产生荧光,荧光越_______,说明水体中_________

__________污染越严重。(类物质)

雌激素强

RNA聚合酶

不能

能

解析

(1)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。要使vtg基因与Luc基因载体形

成重组载体并降低“空载”概率,应选用两种不同的限制酶进行双酶切,已知“Luc基

因缺乏启动子序列,而vtg基因内部含有启动子序列”,故应将vtg插入Luc的上游,观察图

2,Sau3AⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点位于Luc基因的上游,但是Sau3AⅠ也可识别

BclⅠ的识别序列,故选用EcoRⅠ和HindⅢ。(2)通过PCR获取vtg基因时,引物需要与模

板链3'端互补配对,引物1要与vtg基因的“3'-TTGATA-5'”互补配对,故引物序列为5'-AACTAT-3',且要保证vtg基因插入Luc基因载体,需要在引物1的5'端添加EcoRⅠ的识别

序列,EcoRⅠ的识别序列是5'-GAATTC-3',故引物1应包含5'-GAATTCAACTAT-3',A正

确。(3)重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因,而四环素抗性基因因酶切被破坏,所以导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长,不能在含有

四环素的培养基中生长,即能在氨苄青霉素培养基中生长,不能在四环素培养基中生长

的大肠杆菌为目的菌。(4)E蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是RNA聚

合酶,它能催化核糖核苷酸聚合形成RNA。当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因

的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋白,Luc催化荧光素产生荧光,荧光越强,说明表达的

vtg-Luc融合蛋白越多,即水体中雌激素(类物质)污染越严重。6.★★★★(2025届江西学业水平选择性考试九)荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变

化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是

目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题:(1)TaqMan探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接荧光基团

(Q),当探针完整时,两个基团距离很近,两个荧光基团相互发生淬灭而不能检测到荧

光。在qPCR过程中,当TaqDNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F

发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。

①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、TaqDNA聚合酶、_______和dNTP

(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历_______、_______、延伸三个阶段,其中

延伸阶段是从引物_______(填“3'”或“5'”)端开始的。

3'

复性

变性

引物

②在qPCR过程中,TaqDNA聚合酶的两个作用是_________________________________

__________________________________________。③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,保证复性时探针先于引物与

模板DNA结合,原因是_______________________________________________________

________________________________________________________________。(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度________(填“增强”或“减弱”)。通过

实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应

的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈___________(填“正相关”或

“负相关”)。(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,负相关

增强

新链时,就能顺利遇到并水解已结合在模板上的探针,使其发出荧光信号

可确保在随后的延伸阶段,当TaqDNA聚合酶从引物开始合成核苷酸连接到核苷酸链上,能水解Taqman探针

TaqDNA聚合酶能够催化游离脱氧还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测

结果,从Ct值的角度进行分析,患者______(填“A”“B”或“C”)出现肿瘤的概率更

大,原因是_________________________________________________________________

________。因较多

由于患者A达到荧光阈值时的循环次数比较少,因此其起始模板的肿瘤基

A

解析

(1)①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、TaqDNA聚合酶、引物和

dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历变性、复性、延伸三个阶段,子链延

伸方向是5'→3',即延伸是在引物的3'端开始的。②在qPCR过程中,TaqDNA聚合酶能

够催化游离脱氧核苷酸连接到核苷酸链上,还能水解Taqman探针。③Taqman探针的复

性温度应比引物的高,这有利于保证复性时探针先于引物与模板DNA结合,可确保在随

后的延伸阶段,当TaqDNA聚合酶从引物开始合成新链时,就能顺利遇到并水解已结合

在模板上的探针,使其发出荧光信号。(2)在qPCR中,由于TaqDNA聚合酶遇到探针时

会使探针水解而释放出F,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,故荧光强度可反映新合

成目的DNA的量,随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度会增强。Ct值是qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则待测样本中

目的基因的个数越多,达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数(Ct值)越小,因此Ct值

与待测样本中目的基因的个数呈负相关。(3)由于患者A达到荧光阈值时的循环次数

比较小,推测其起始模板的肿瘤基因较多,因此患者A出现肿瘤的概率更大。第3节基因工程和蛋白质工程考法1限制酶的选择:T5、T6、T8、T9、T10考法2转基因“受体细胞”的筛选:T2、T3、T4、T6、T8、T9、T10五年高考1.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD1

63蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),

使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去()

A.CD163基因中编码起始密码子的序列

B.CD163基因中编码终止密码子的序列C.RFP基因中编码起始密码子的序列

D.RFP基因中编码终止密码子的序列

B

解析根据题干信息,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起,如果两个基

因中编码起始密码子和终止密码子的序列完整,将得到两条多肽,若想只表达出一条多

肽,结合图可知,CD163基因编码起始密码子的序列需保留,编码终止密码子的序列需除

去,使得CD163基因翻译结束后不停止,继续合成红色荧光蛋白RFP,即可得到一条多肽,

B正确。2.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标

记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的

质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是

()A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形

成菌落

D

解析用HindⅢ酶切后,目的基因可能会出现正向插入和反向插入两种情况,而目的基

因均从启动子一侧开始转录,故目的基因转录的产物可能不同,A正确;用PvuⅠ酶切后,

TetR未被破坏,无论该质粒是否含有目的基因,都能在含Tet的培养基中存活,B正确;插入

目的基因的重组质粒比空质粒大,故重组质粒与空质粒电泳后条带的位置不同,故可以

用电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否,C正确;用SphⅠ酶切后,插入目的基因的质粒

上的TetR被破坏,受体菌不能在含Tet的培养基上存活,D错误。3.★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至

枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-

Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以

侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术

获得抗病植株(如图)。回答下列问题。

(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过_________________(方法)将该质粒转入

植物细胞,并将_____________________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转

化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加___________。潮霉素

Ti质粒上的T-DNA

农杆菌转化法

(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________,对其消毒时需依次使

用酒精和____________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂

素,原因是______________________________________________________________。(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用____________________技术检测目标

基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水

稻分别接种白叶枯病菌,通过比较____________________________________________来验证抗病性。(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为____________________

__________________________________________________________。的启动子区进行定点修改后,白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻

对感病基因SWEET病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案)

DNA测序(或PCR)

生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素

次氯酸钠

外植体

解析

(1)将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)能够整合到植物细胞的染色体DNA上,利用农杆菌侵染植物细胞,

从而将重组Ti质粒导入植物细胞中。由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因(HygR),因

此需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素,只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能

在含有潮霉素的培养基上存活。(2)在植物组织培养中,离体的植物器官、组织或细胞

被称为外植体,所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。对水稻幼胚消毒时需依次

使用酒精、次氯酸钠处理。在植物组织培养过程中,生长素和细胞分裂素的不同配比

可以调控细胞的分化方向,从而诱导形成根和芽等不同的器官,最终形成再生植株,因此

生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,可采用DNA测序技术或PCR检测目标基因的启动子区是否被成

功编辑。在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过

比较病斑的大小(或病斑面积、发病情况等)来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病

斑明显小于野生型水稻,说明其抗病性增强。(4)据题干信息可知,感病基因SWEET可以

被白叶枯病菌利用以侵染水稻,若对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改,则白叶

枯病菌无法利用该基因侵染水稻,从而使水稻获得抗病性。4.★★★(新思维·重组菌的目的基因产物杀菌活性丧失的原因分析)(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方

向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用__________引物。

本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是__________________________________。(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应

产生______条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是___________________________。(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带_____________(填氨基酸名称)的

tRNA进入结合位点,导致_____________,最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取

的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是___________________________。若运

用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有____________________________________________(答出1点即可)。发酵目的基因发生突变(或变异)

翻译受阻

苯丙氨酸

验证重组质粒是否构建成功

2

保证载体能在链霉菌细胞中正常复制

F2、F4

条件优化(或产物的分离和纯化方法等)

解析

(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,所选的两种引物需

分别与目的基因模板链的3'端互补,且方向相反,子链延伸方向为5'端→3'端,因此应选用

F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点,是为了保证载体能在链霉菌细胞中正常复

制。(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,会得到载体片段和目的基因

片段,共2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功,若能

得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带,说明重组质粒构建成功。(3)位点1

为AUG,为起始密码子,位点2为UUC,编码苯丙氨酸,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止

携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点,导致翻译过程无法正常进行,进而使细菌无法合

成蛋白质,最终引起细菌死亡。(4)重组链霉菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是目的基因发生突变(或变异),导致其表达的产物结构改

变,从而失去杀菌活性。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需

进一步研究的问题有:优化发酵条件,如温度、pH、溶氧量等,以提高发酵产物的产量;

产物的分离和纯化方法等。5.★★★★(新考法·在载体中逐个插入3个基因的分析)(2025河北,22节选)为治理水

体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、

定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞

衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题:(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐

渐减少的是_________和_______________________________。模板与引物在PCR反应

的____________________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因

为_________________________________________________________________。(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1

PCR时不耐高温的DNA聚合酶会失活(或“PCR过程在高温下进行”)

复性(或“退火”)

脱氧核苷酸(前两空顺序可颠倒)

引物

和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限

制酶识别序列,其中GP1两端应添加__________________(填两种限制酶)的识别序列。

用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成____________键。磷酸二酯

SmaⅠ、EcoRⅠ

解析

(1)在PCR过程中,引物和脱氧核苷酸参与形成新的DNA链,分子数量会减少。

PCR包括变性(双链DNA解聚为单链)、复性(引物通过碱基互补配对与模板DNA结

合)、延伸(脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA

链),故引物与模板在复性阶段开始结合。由于变性阶段温度过高,为防止DNA聚合酶

变性失活,因此PCR中使用的DNA聚合酶需要耐高温。(2)据图中限制酶识别序列及切

割位点可知,NheⅠ和XbaⅠ是同尾酶,限制酶切割后会产生相同的黏性末端,容易导致

目的基因和载体的自身环化和反向连接,故可选NheⅠ(或XbaⅠ)和SmaⅠ切割CADR基

因;依据基因连接顺序和酶切位点可判断,可选SmaⅠ和EcoRⅠ切割GP1基因、EcoRⅠ

和EcoRⅤ切割YFP基因。DNA连接酶可催化DNA片段之间磷酸二酯键的形成。6.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、

产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答

下列问题。(1)可从__________________________中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1

所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分

别引入________和___________限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用

_____________________________________________连接DNA片段,构建重组质粒,大小

约9.5kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。

DNA连接酶/T4DNA连接酶/E.coliDNA连接酶

XbaⅠ

XhoⅠ

序列数据库(如GenBank)

(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行

PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的

模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有_______________________的污染。初步判断外源DNA/外源基因N

实验组______(从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是________________

__________________________________________________________________________

________________________________________________________。DNA电泳图中1号样品大小接近,因此判断该组基因N导入成功

7.2kb,重组质粒大小约为9.5kb,可推断插入的基因N约有2.3kb(2300个碱基对),与质粒pYL大小为

1

(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序

列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸

编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,

其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有________。

(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的____________含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。香树脂醇

GCC解析

(1)GenBank是目前国际上广泛使用的序列数据库之一,它的数据主要是各国的

实验室、测序机构等发布的序列信息。利用这个数据库,我们可以便捷地检索到基因

和蛋白质的序列信息。故可从序列数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物,

PCR扩增基因N。基因N应插入pYL的启动子和终止子之间,由图1可知,用于切割pYL

的限制酶应为SpeⅠ和XhoⅠ,但若用SpeⅠ切割基因N会使该基因的结构被破坏,因此可

用同尾酶XbaⅠ代替SpeⅠ切割基因N。为保证基因N与质粒pYL正确连接,需确定基因

的上下游。基因上游与质粒的启动子相连,故引物2的5'端需添加XbaⅠ识别序列;基因下游与质粒

的终止子相连,故引物1的5'端需添加XhoⅠ识别序列。(2)由(1)中重组质粒(约9.5kb)和

图1pYL(7.2kb)数据可知,基因N约为2.3kb(2300个碱基对)。引物1和引物2可扩增基

因N,由图2结果可初步判断实验组1的质粒成功插入了基因N。在第5组的PCR中,使用

无菌水代替实验组模板DNA的目的是检验PCR中是否有外源DNA污染。(3)由题意可知,引物a可使模板中第240位脯氨酸的碱基序列替换为丙氨酸的碱基序列(GCA),另一

引物(引物b、c、d中的一条)可使第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为丙氨酸的碱基序

列,因引物a和