CN119490603A 一种长效重组单链促卵泡素融合蛋白、基因、制备方法及其应用 （宁波第二激素厂）

一种长效重组单链促卵泡素融合蛋白、基亚基之间的连接序列；所述LinkerE2的氨基酸21.一种长效重组单链促卵泡素融合蛋白，其特征在于，该蛋白结构式从N端到C端为2.根据权利要求1所述融合蛋白，其特征在于，编码Li3.编码权利要求1或2所述融合蛋白的基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:13所4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含1）将FSHβ_LinkerE2_FSHα片段，通过NheI和EcoRI双酶切插入至表达载体7.权利要求1或2所述的融合蛋白或权利要求3所述的基因在制备刺激雌性动物卵巢生8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物3促性腺激素释放激素（Gonadotropin_releasinghormone，GnRH，亦称促黄体素释放激素[0003]FSH和LH均由α和β两条多肽链（或称亚基）分别通过非共价键结合形成功能性单迄今已见诸于报道的有关重组FSH的基因工程策略主要有两种。一种是α和β两条多肽链分4表达过程中所受到的制约也有所差异，重组融合糖蛋白的糖基化程度和表达量也不尽相高效应的FSH最佳序列还有待于进一步发掘。对于如何设计具体的某一特定功能的融合蛋电荷效应以及所构成连接序列的长度和刚柔性等特性设计一系列含不同连接序列的长效[0008]所述的表达量是以中国仓鼠卵巢(Chinesehamsterovary,CHO)细胞作为宿5[0012]步骤三、将上述经PCR置换和扩增的含不同Linker和双酶切位点（例如NheI和[0013]步骤四、从已转化的大肠杆菌提取质粒，各序列确定后分别转染中国仓鼠卵巢6[0029]综上，本发明提供了新型的用于重组长效单链FSH融合蛋白的连接序列的基因序[0032]图3为采用卵泡刺激素生物测定法比较卵泡刺激素类似物的生物活性的剂量_卵β_Linker_FSHα。其中FSHβ和FSHα相应的序列源自基因银行（GenBank编号分别为NM_过链接序列C1连接的长效重组单链促卵泡素基[0036]2.1通过定域置换PCR技术将FSHβ_LinkerC1_FSHα中的LinkerC1依次置换为不782.2.1[0045]2.2.3.[0048]2.2.4.9[0051]2.2.5.[0054]2.2.6.[0057]2.2.7.[0060]2.2.8.[0063]2.2.9.[0066]2.3上述定域置换是依次通过三轮PCR制备一个含独特连接序列的单链FSH候选[0079]以上PCR产物的萃取纯化是通过本行业技术人员所熟知的1%琼脂糖凝胶电泳实现[0081]3.1.将上述含不同连接序列的10个单链FSH的候选序列和表达质粒pcDNA3.1表5.双酶切体系[0082]将上述酶切体系混匀后，37℃水浴孵育4h。酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分[0083]3.2将上述含不同连接序列的候选序列经NheI和EcoRI双酶切后获得的目的表6.连接反应体系[0084]连接产物即含有不同linker的FSH重组表达载体，经过本行业技术人员所熟知的2提取质粒。依上述3.2双酶切方法验证后送测序确认。克隆的基因表达物为分泌型目的蛋钟，5mL含10%血清F12营养培养基吹用对照组中表达量最高的FSHβ_Link1.重组单链FSH在CHO_K1细胞中的在24孔板中接种CHO_K1细胞（1xl05个细胞每孔待细胞长到50％汇合度时，换果表明G418浓度大于200μg/mL的细胞培养孔中均无活细胞存在，因此细胞筛选培养基的基分别调释其余组细胞密度至1xl06细胞表达载体pcDNA3.1(+)_FSHβ_LinkerC4_FSHα和pcDNA3.1(+)_FSHβ_LinkerE2_FSHα两组组的细胞培养液1.0mL中所含的分泌型目的蛋白约与0.8mLE27转染组的细胞培养液中T[0101]1.4.测定结果与分析：取19_22日龄同一来源的SpragueDawley健康雌性幼大[0104]2.量反应平行线测定：按照中国药典[0107]*P<0.05否定无效假设的[0110]*P<0.05否定无效假设的接序列的长效重组单链FSH的效