仪器分析实验讲义

实验一单光束分光光度计的结构、性能和使用...................2

实验二双光束扫描分光光度计的校正与使用.....................9

实验三多组份混合物的分光光度法定量分析....................17

实验四酸碱指示剂解常数的测定...............................19

实验五930型荧光光度计的使用与定量分析.....................22

实验六核磁氢谱计算机辅助解析...............................26

实验七质谱计算机模拟实验..................................30

实验八红外光谱定性分析（聚苯乙烯膜）......................38

实验九红外光谱辅助教学实验................................40

实验十土壤样品的发射光谱定性分析一摄谱.................42

土壤用品的发射光谱定性分析—识谱..........................45

3配―H*।口j^RtFI'.....50

实验十二气质联机的应用51

实验十三液质联用技术52

实验一单光束分光光度计的结构、性能和使用

一、实验目的：

了解分光光度计的基本结构一性能一应用的关系：掌握正确使用单光束分光光度运

用光谱仪器技术与测试技术，取得真实的光谱数据，进，亍吸收光谱定量分析的原理与方法。

二、实验要求：

1、学习分光光度计的结构、性能及使用，并仔细体会上述三者的关系一这是掌握吸

收光谱仪器技术的基础。

2、了解光谱分析中表观值与真值的概念，掌握用单光束分光光度计，以相对测显的方

法测定样品，取得真实吸收光谱数据，进行定量分析的实验技术一一这是掌握吸收光谱检测

技术的基础。

三、实验原理：

进行光谱分析的基本步骤是：①正确运用光谱仪器技术与调试技术，取得真实反应样品

特征信息的光谱数据，简称真实光谱,②对真实光谱数据进行解析以确定样品的结构和组成。

运用光谱仪器测试样品就是为了得到真实的光谱，以实现第一个步骤。

实际在测定光谱的信息传递过程中，会有各种干扰信号叠加到分析信号上去，致使在检

测器的输出端所得的信号并不只是反映了样品的性质，还与仪器的特征与测量的条件等有

关，这样的测定值称为表观值；仅仅与样品的性质有关、真实反应样品特征的测定结果称为

测定的真值。所谓“真实”是相对的，可以用准确度、精确度等参数表示测定结果的可靠性。

本实验作为现代仪器分析课的第•个实验，特别要注意学习取得真实光谱的理论与方法。

为了取得真实光谱，采用的基本手段有两种：光谱分析仪器技术与测试技术。首先是选

用仪器的性能必需符合测定的要求，并且要设置适当的测定参数；虽然光谱仪的类型极多，

但其基本结构、性能与使用一致，掌握这些基本问题是运用光谱仪器技术的基础；此外要运

用合适的测试技术，例如本实验学习用相对测量法取得样品的真实光谱。

（一）分光光度计的基本结构、性能一一吸收光谱仪器技术的基础：

分光光度计是用于测定样品吸收光谱的一种光谱仪器，它的基本结构包括三大部分：分

光系统（又包括光源、单色器）、样品室与光度计系统（又包括检测器、数据处理及结果显示部

分）。分光光度计的性能指标有：分光系统的波长准确度、精确度、杂散光以及波长分辨率,

光度计的准确度和精确度，整机的噪声（信噪比）与基线平坦度等。这些性能有的决定于分光

光度计整机的结构与工艺，有的决定于分光光度计的调试与使用。

波长分辨率或称最小分辨波长是分光光度计最重要的性能之一，波长分辨率决定于分光

光度计中单色器产生单色光的带宽△X；而带宽决定于分光光度计的结构和测定样品时设定

的参数，主要是线色散率dL/d入以及狭缝宽度S。它们间的关系是：

AX=S/（dlVdX）（I）

式中线色散率dL/dX决定于分光光度计的结构；狭缝宽度S则与结构和设定值

都有关。由上式可见狭缝越大线色散越小则单色光的带宽越宽，分辨率越差。•股分光光度

计的狭缝是可调的（本实验所用的72型分光光度计狭缝是固定的），但因为狭缝宽度与本色

器输出的单色光能量平方成正比，测定样品时为了保证一定的单色光能量输常，因此狭缝宽

度的低限受制约于仪器的灵敏度，如整机的电信号放大倍数、检测器与显示器的灵敏度等，

这些都决定于分光光度计的整机结构。

分光光度计的线色散率是指在出光狭缝的位置，每邑位波长间隔的单色光成分，在光谱

带中被展开的距离。线色散率用dL/d入表示，它决定于分光光度计的结构，其表达式是;

dL/dX-FdS/dX（2）

2

式中F是分光光度计成象物镜的焦距，72型分光光度计该值约125mmn

db/d入是分光光度计中色散器件(如棱镜或光栅)的角色散率，它决定于分光光度计中

色散器件的特性,在棱镜分光光度计中棱镜的角色散率决定于棱镜材料的折射率n与色散率

dn/dX,其估算公式是

dS/dX=[2/A/4-W2J•(dn/dX)(3)

以上用(1),(2),(3)公式计算的方法可作为估算分光光度计单色光带宽的第〜种

方法。

分光光度计的单色光带宽也可通过直接测定出光狭缝宽度S，并用尺量出在该处可见光

的谱带被展开的宽度1,然后根据可见光谱带中包含的光谱范围约等于300nm(700-

400nm),由此可计算分光光度计的平均线色散率dL/dX=]/△入再按(1)式计算单色光带

宽。这是一种半计算半测定的方法，可作为估算分光光度计单色光带宽的第二种方法。

分光光度计的单色光带宽还可按光谱学方法来测定，把某一窄带光谱线(谱线的宽度窄

到可以不计，如本实验所用的干涉滤光片产生的单色光与下••实验所用的笊原子的发射谱线)

引入分光光度计中，分光光度计将其展宽的程度(分光光度计上扫描该谱线所得光谱的半宽)

就相当于该分光光度计的单色光带宽。可作为估算分光光度计单色光带宽的第三种方法。

本实验用上述三种方法来测定和计算72型分光光度计的单色光带宽：通过上述三种对

分光光度计单色光带宽的计算和测定，实验者要仔细体会分光光度计性能的结构基础。

(二)比尔定律及其应用一一吸收光谱检测术的基础：

用比色方法进行定量分析的基础是朗伯一比尔定律，简称比尔定律,这个定律告诉我们：

物质对某频率辐射的吸收与吸收介质的浓度和浓度成正比对于单一组分的样品存在下列关

系：

A=a•b,c(4)

式中A为吸光物质对某一频率单色光的吸光度；a表示物质分子对该频率单色光的吸收

本领，称为吸光系数；b为吸光物质的厚度，称为光程；C为吸光物质的浓度。

吸光度A等于透过率T(通过样品后的光强1/入射光强10)的负对数：

A=­logT(5)

透过率也称透光率T,等于通过样品后的光强I与入射光强(或通过参比后的光强)

10之比：

T=I/Io(5‘)

因此用比尔定律作定量分析实际是通过测定T进行定量的一种相对测量方法。应用比

尔定律作定量分析要求具备一定的条件，有关问题参见教科书在技术上的要求是获得单色

光，并具备测量单色光及其通过样品后光强度的仪器，分光光度计就是这样的仪器。

分光光度计的光源、的色器和检测器等都有一定的光谱持性，当样品放在分光光度计的

光路中时，这些部件的光谱特性与样品的光谱特性叠加在一起因此该测定值是表观值。所以

必须采取一定的措施来消除仪器的特征对测定的影响，获得仅仅与样品的性质有关的真实光

谱。用比耳定律作定量分析的相对测量的方法是•种消除仪器光谱特性，取得真实光谱的的

方法：

按照透过率的定义，相对测量是指测光器件未受光照射时的信号输需为透过率0%,即

吸光度为无穷，以光路中放入参比时，光照到测光器件上产生的输出信号调为透过率100%,

即吸光度为零；这个过程称为调满度(本实验以圆mV电压表为显示器，由于灵敏度的限制，

若不能以100mV作为1伽％,调为满度，也可以将任一电压值调为满度，然后按(5)式计算

T),样品放入光路后，分析光I投射到光元件上，产生的信号介于透过率0%到100%之间。

有了上述透过率100%和。％这两个参考点后，在检测器输出端获得的信号就仅仅反映样品

3

的光谱特性了.

按照透过率的定义，相对测量也可以对每一个测定的波长点分别测得I与Io的对应值,

然后按(5')式计算T.

(三)分光光度计的性能及其与应用的关系：

分光光度计的性能决定于结构，但性能又决定了它的应用范围。本实验用72型分光光

度计测定叶片提取液中叶绿素的含量，方法是测定样品在663和645nm处的吸光度A(663)

与A(645),然后由下式(Aronon公式)计算样品中叶绿素a,b的含量，

叶绿素a的浓度Ca=12.72A(663)—2.58A(645)(6)

叶绿素b的浓度Cb=22.87A(645)—4.67A(663)(6‘)

叶绿素a,b含量的比一般为3—4比1。但用72型分光光度实际测定计算的叶绿素a,

b含量比的误差可能高达几百％,从中思考分光光度计的性能及测定参数的设置对测定的影

响。

四、仪器与材料：

72型分光光度计、窄带干涉滤光片(红区.兰区各一片)、1cm比色池两个、0.02mM的

橙黄G溶液、叶绿素提取液。

五、实验步骤：

实验开始时先对照本实验的附录，观察72型分光光度计的基本部件，及它们间的段系，

然后按下列步骤进行实验：

1.分光光度计基本结构和功能的观察：

1.1.观察已被打开的72型分光光度计，找出其光源，单色器，样品室。检测器和狭

缝。

1.2.转动光量旋钮，观察仪器内部器件的动作。思考器件的作用。

注意：不要用手接触仪器内部的光学器件。

2.分光光度计单色光带宽的估算：

2.1.打开稳压电源开关，打开光源开关。

2.2.按“实验原理'中的第二种方法估算分光光度计的单色光带宽：转动波长旋钮,

观察仪器有大部件的动作及狭缝附近“彩虹”(即光谱带)的移动.

测出谱带的宽度与狭缝宽度，以此估算72型分光光度计在全谱区内的单色光平均带

宽。记录：

72型分光光度计在出光狭缝处光谱带的宽度是(mm)：

在该光谱带中包含的单色光范围约(nm)到一(nm),

由此计算分光光度计的平均线色散率dl/dX为(mm/nm)；

测量•72型分光光度计的狭缝宽度S是(mm)；

由此估算72型分光光度计全谱区内的平均单色光带宽(nm)。，

思考：单色器狭缝与分光光度计性能的关系是什么？

2.3.测出成象物镜的焦距F为(mm)

3.用光谱学方法测定分光光度计波长精度和单色光带宽：

上一步从分光光度计的结构计算了单色光带宽，这一步用光谱学方法实际测定分光光

度计单色光带宽(即“实验原理”中第三种测定单色光带宽方法)；并测定分光光度计波长

精度：

3.1.打开稳压电源开关，打开光源开关，打开万用表开关，将万用表拨到直流电压

测量挡，量程选于200mv.

3.2.以空气为参比，按透光率定义(每个波长点都用参比调满度后测定样品，或分别测

定I与1。后按5式计算T,详见原理部分)测定两种透过峰值波长和带宽均已知的、窄带

4

干涉滤光片的透光率曲线，测定的波长范围为实际峰值前后各3()nm、波长间隔自定,

思考：“72”型分光光度计是否需要调零点？

为何每个波长点都用空白调满度后再测定样品?

记录数据：

波长较短的干涉滤光片：波长(nm),带宽(nm)

波长

(NM)

透过率

(%)

计算分光光度计在蓝区的单色光带宽为(nm),波长误差为(nm)

波长较长的干涉滤光片：波长(nm),带宽(nm)

波长

(NM)

透过率

(%)

计算分光光度计在红区的单色光带宽为nm.

波长误差为(nm)

注意：后面的有些实验需要校正波长后再进行

3.3.从窄带干涉滤光片的透光率曲线计算分光光度计单色光带宽。思考在这一步与上一步

(1.2)单色光带宽的结果为什么不一致？

4.单光束分光光度计的正确使用一了解分光光度计的光谱特性对分析的影响以及测定真

光谱的方法：

4.1.测定分光光度计的能最输出曲线：

①在比色池中装入约2/3的蒸储水，把比色池放在仪器的比色架上，并送入光路，盖上样品

室盖。

②开光闸，调节波长旋钮并观察万用表输出指示，在420-660nm间找出能量输出最大的波

长，用光量旋钮将此时的输出调为某VlOOmv值(思考为何进行这一步？),以后不再改变

光量。

③记录420—600nm范围内每隔20nm的电压输出，该值随波长的变化即能量输出曲线。(思

考：能量输出曲线决定那些因素？对分析有何影响？)

42测定橙黄G溶液的表观透过率曲线：

在另一比色池中装入0.02mM橙黄溶液，高度约2/3,将其送入光路，盖好样品室盖,

在与上一步相同光量的条件下记录420—660nm范围内每隔20nm的电压输出，该值随波长

的变化即橙黄G表现透过率曲线.(思考，表现透过率曲线决定于哪些因素?)

4.3.测定橙黄G溶液的真实透过率曲线：

用蒸储水作参比，同3.2的步#骤(每个波长点都用参比调满度或分别测定I与10后

按5式计算T)测定0.02mM橙黄G溶液的真透光率T曲线：记录420~660nm范围内每隔

20nm的电压输出，该值随波长的变化即橙黄G的真透光率曲线。记录数据：

5

波长(nm)

能量输出(MV)

橙黄G表观透光率

(%)

橙黄G真实透光率

(%)

注意；橙黄G溶液的真实透过率曲线与其表观透过率曲线的不同，体会“72”型分光

光度计的正确使用。

5.用“72”型分光光度计测定叫绿素提取液的浓度--了解分光光度计的性能对分析的

影响，

测定叶绿索提取液的真实透光率：用80%丙酮作参二匕按透光率的定义同3.2的步

骤，测定叶绿素提取液的真透光率曲线：

记录630—680nm范围样品下列波长点的透过率，该值随波长的变化即叶绿素提取

液的真透光率曲线。记录数据(先校正波长)；

波长(nm)640645650660663670680

叶绿素提取液的

真实透光率(％)

六、思考题：

1.限制分光光度计带宽的因素有哪些?72型分光光变计的主要限制因索是什么？

2.仪器的单色光带宽等于滤光片透光率曲线半高宽的关系在何条件下存在？

3.仪器的波长精度和单色光带宽对测最有何影响？

4.还有什么方法可以测定仪器的单色光带宽？

七、实验报告内容：

1.画出72型分光光度计的基本光路图，在图中标出分光光度计的主要部分的名称。

2.研究72型分光光度计的性能及其与结构的关系：

①利用实验步骤2中数据作出红.兰滤光片的透光率的曲线，由此计算：

(1)求出红区和兰区最大透光率的波长；

(2)求出仪器在红区和兰区的波长误差；

(3)求出仪器在红区和兰区的单色光带宽(即滤光片透光率曲线的半高宽)；

②用“实验原理”中的(1),(2),(3)三个公式计算72型分光光度计在兰区和红区

单

色光的带宽，有关计算需要的数据见下表：

兰IX红lx

棱材料的平均折射率n1.671.65

材料的色散率dn/d入2.5XI0-^/nm0.9X10^/nm

镜角色散率d6/dX4.2X10-4/nm1.6XIO"4/nm

分成象物镜焦距F(mm)

光线色散率dl/d%(mm/

光nm)

度狭缝宽度S(mm)

计单色光带宽△X(nm)

6

③把三种方法作的单色带宽的计算值和实验测定值用比较，它们是否一致?为什

么?并讨论为什么红区和兰区的单色光带宽不一样？

④由72型分光光度计的结构说明72型分光光度计单色光的带宽决定于什么样因素？

3.画出实验所测定的72型分光光度计能量输出曲线、样品的表观光谱与真光谱。说明各

曲线坐标是什么?讨论这三条曲线的关系，以此说明分光光度计在测定样品前为什么必需进

行零点与满度的校正?影响真实光谱的还有那些因素?讨论如何选用合适的仪器、设置适当的

测定参数、运用相对测量法取得样品的真实光谱，完成光谱分析的第一个基本步骤？

4.由实验所测得的叶绿素提取液在663nm和645nm的吸光度，根据公式（6）,（6'）,

分别计算样品中叶绿素a,b的含量及a,b含量的比值。讨论测定结果是否准确？

为什么?下一实验中在190型扫描分光光度计（单色光带宽为2nm）上测定同一样品的叶

绿素a,b含量与a,b含量之比，把这两次实验结果相比较，预计的结果如何？

八、附录一：DM—100型万用表的使用

本实验把DM—100型万用表作为72型分光光度计的显示器，显示分光光度计的电压

输出。

万用表是常规电测量的测量工具，利用万用表一般可以测量电压，电流和电阻，测量

的范围和精度因方用表的不同然而有所不同DM-100型是三位半数字万用表，可测量

交直流电压、直流电流、电阻和晶体管的直流放大倍数，仪表的左面是方式（电压、电流或

电阻）选择开关和量程选择开关，测量时须按入方式选择开关中的一个和量程选择开关中的

一个，表笔接在仪表下部为适当插孔中，测量的过程一股是：

（1）打开电源开关；

（2）选择方式和量程；

（3）将表笔的小插头插到相应的插孔中；

（4）测量;

（5）测量完毕将电源关闭。

在进行第三步和第三步时请注意利用表盘上不同颜色的标志，以免出错。

附录二：72型分光光度计操作说明

72型分光光度计是一种单光路的最简单的分光光度计。其色散器件是玻璃棱镜，因此

只能在可见区工作：其检测器是硒光电池，没有任何信号放大系统，因此狭缝很宽，致使单

色光带宽很大（分辨率很差），只能用于吸收峰较宽样品的定量分析。

72型分光光度计的基本结构分三部分：电源、分光光度计主体与显示器（数字电压表）。

电源部分供给主体中光源用电，主体部分包括光源、单色器、样品室、检测器；检测器输出

的信号直接由数字电压表显示。该机结构简单，但包含了分光光度计的基本系统，适合于作

光谱分析入门的实验。

72型分光光度计操作步骤如下：

首先检查72型分光光度计的基本结构分三部分：电源、分光光度计主体与显示器

（数字电压表）是否连接好，如果已连好，按下列步骤测定样品：

1.接上电源，打开稳压电源上的电源开关，此时稳压电源上的指示灯亮；打开分光光

度计的光源，此时分光光度计的光源灯亮。

2.将数字万用表上的“POWER”开关拨至“ON”，选择直流200MV挡，（按入左边从

上数第三键和第四键）。

3.检查0%：将光源前的遮光板（光闸）拨向黑点，盖好样品室盖，此时万用表指示应为

零。

4.100%调节：将空白（参比）溶液装入比色皿，放入样品室，盖好样品室盖，利用样品

架推干将空白液送入光路，将光闸投向红点，调节波长选择至所须波长，调节“光量”

7

钮使

万用表示值为一定值（如10mv）o

5.透光率测量，将样品溶液装入比色皿，放入样品室，盖好样品室盖，用空白液调好

100%后将样品液送入光路，在不改变“光量”的条件下读出万用表的示值，此示值与

空白

时的示值之比就是样品液的透光率。

6.关机，将万用表“POWER”开关拨向“OFF”，关稳压电源上的电源开关，拨下电

源

插头，取出比色皿洗净放好。

8

实验二双光束扫描分光光度计的校正与使用

一、实验目的与要求：

学习正确运用双光束扫描分光光度计的仪器技术与测试技术进行吸收光谱分析，学

会检查双光束分光光度计性能的方法。

二、实验原理：

在使用单光束分光光度计时，每改变一次测量波长都需要用参比溶液进行校正满度，这

使得宽波长范围的分析与吸收光谱的测定很不方便。双光束分光光度计可将单色的分析光分

成两束，分别通过样品和参比溶液，同时进行每个波长的样品光束强度（通过样品后的光强

度I）与参比光束强度（通过参比后的光强度，相当于分析光通过待测成份前的强度⑹的测

量，然后通过仪器的内部运算，得到样品各波长点的透过率T（=I/I。）或吸光度A（=—

iogT）：因此运用双光束分光光度计，能很容易地获得样品的吸收光谱。本实验所用的分光

光度计是UV—190型双光束扫描分光光度计，其性能与使用参见附录说明。

分光光度计的性能对测定有重大的影响，分析样品前应对其检查与校正。

1.双光束分光光度计性能的检查与校正：

分光光度计的性能好坏将直接影响测量结果的正确性。表示分光光度计性能的参数

有；波长准确度与精确度（注意二者的差别）、吸光度准确度与精确度（注意二者的差别）、

单色光带宽（决定分光光度计的分辨率）、杂散光的大小、基线漂移、噪声的大小和100%

线的平坦度等（思考这些性能对分析的影响）。本实验是实验一的继续：在双光束扫描型分

光光度计上，更全面地研究这些性能。

波长准确度的检查方法是给分光光度计以某•标准波长的谱线（•般都是以物质的电

子在不同能级之间的跃迁为基础的发射线或吸收线），记录分光光度计给出的实际示值：并

以实际值与标准值之差表示分光光度计的波长准确度。本实验利用D2灯的656.Inin发射线

和苯蒸汽的吸收线（247.1、252.9、258.9nm）为检查分光光度计的标准线。吸光度准确度

的检查方法也是以具有标准吸光度的物质进行校正。单色光带宽的检查方法一般是给仪器以

一很窄的谱线（这种谱线本身的宽度窄到可以不计的程度，通常是某些特征发射或吸收的原

子谱线）。记录分光光度计招这一谱线展宽的程度。展宽后的语线的半高宽就是仪器的单色

光带宽。本实验用D2灯的656.Inm谱线作为标准，检杳分光光度计的波长准确度。（请与

实验一比较）杂散光的检查方法是在一定波长下，把对这一波长光儿乎完全吸收的物质放在

光路中，这时记录分光光度计检测器所检测到的信号就是杂散光强度。

基线漂移是温度等原因引起的输出信号向某一定方向的偏移；噪声是输出信号的大小与

方向随机变化的偏移。它们的检查方法是在一定条件下（不改变波长），记录分光光度计一段

时间内的信号输出，以这段时间内信号输出的变动范围作为漂移和噪声的指示（思考这二者

有何差别）.

100%线平坦度的检查方法是当样品光路与参比光路置空时，在分光光度计的全谱区内，

记录100%值随波长变化的程度。

2.双光束分光光度计的应用

由实验一可见分光光度计的性能决定于结构，分光光度计的性能乂决定了其应用的范围

与效果。吸收光谱定量分析要求光谱仪的波长分辨率（单色光带宽）小于样品吸收峰半宽的1

/5〜I/10；叶绿素溶液的吸收峰半宽约18nm因此测定叶绿素的光谱仪产生的单色光带宽

应小于2nm左右。“72”与“190”型分光光度计的带宽分别约20nm与2nm,因此前一分

光光度计不能准确测定叶绿素含量，后•分光光度计可用于准确测定叶绿素含量。

9

本实验用与实验一相同的方法216定同一样品，比较两次实验测定的结果。思考分光光

度计的性能及测定参数的设置对测定结果的影响。

三、仪器与材料：

UV—190分光光度计、苯、叶绿素提取液、卤玻璃片比色池两只。

四、实验步骤：

本实验所用的UV—190扫描分光光度计是日本岛津公司的光谱仪，使用时必需按操

作规程进行。开始实验前应认真阅读本实验后的附录:“UV-190双光束分光光度计说明”,

并对照该说明检查该分光光度计的三个组成部分是否已经连接好，若已连好才能开始实验。

木实验共有两项内容，前一项是按标准方法测定已经在上一个实验中用单光束、低性能

分光光度计测试过的叶绿家提取液样品，比较两种分光光度计测定同一样品的结果，可以了

解分光光度计的性能对测定的影响：后一项是检查分光光度计的性能。

1.测定叶绿素提取液的浓度与透光率、吸光度谱：

用双光束分光光度计，测定叶绿家丙酮提取液663nm与645nm的吸光度，按Aronon

公式计算溶液的浓度值，并和实验•的有关数据比较。再用扫描方式测定叶绿索丙酮提取液

的透光率、吸光度谱，步.骤如下：

1.1.使仪器进入准备状态：

①检查下列开关（主机的左侧）应处于准备位置：

SHIFT（偏移）：开机前应设置SHIFT（偏移）为“0”.

一H.T.AUTO/MANUAL（负高压自动/手动），开机前应为自动（AUTO）。

RESPONSE（响应）：FAST

SCANSPEED（扫描速度）MANUAL

②将电源（POWERSUPPLY）上的POWER开关置于ON,

②根据所需的工作波长范围选择工作灯：

（1）若工作的波长范围是33（）—860nm,用主机上的光源选择秆选用W灯，再将电源上

的W灯开关置于ON；

（2）若工作的波长范围是195—400nm,用主机上的光源选择拨秆选用口?灯，再将电源

上的D?灯开关拨向PREHEAT.预热约5秒钟后，迅速拨向ON；

（3）若要进行全谱区测量，则需将W灯和D?灯都打开，并在分光光度计扫描到350nm

时，切换灯源。

④将电源上的-H.T.（负高压）开关置予ON（思考如果先开负高压，后开灯会如何?并

注意：如果波长显示窗下面的一H.T.ALARM灯亮，请找老师帮助!）

⑤校正分光光度计零点（开机时校一次即可）：

先将RANGE（量程）钊向。一100%,用样品架推杆将挡光黑块送入光路，盖上样品盖,

利用ZERO（调零）钮将透率调至0.00%,待校正零点后再将RANGE钮转到所需要的量

程位置.（思考这一步的作用.）

⑥校正分光光度计满度（开机时在任意一个波长点校一次即可）：

将参比溶液放入样品池和参比池并送入光路，盖好样品盖，利用ABS0钮调节使透光

率读数为“100%”或吸光度读数为“0”。

（思考这一步的作用，与实验一的单光束分光光度计校正有何不同?）

2.用190分光光度计测定叶绿素提取液在663nm与645nm波长处的吸光度或透光率（以

便计算其浓度）：

①设置测定参数（先执行1.1.各步，使仪器进入准备状态）：

（1）将RANGE钮转到所需要的量程位置

⑵先将SCANSPEED钮置于MANUAL位置,然后利用波长调节钮将波长先后调到

10

663nm、645nm,测定叶绿索丙酮提取液吸光度。

注意：1.此时SCANSPEED钮必需处于MANUAL位置，否则将会损坏仪器。

2.分光光度计是由大波长数向小波长数方向扫描的，手工改变波长时一般由小波长

数向大波长数方向返回调节，如果波长指示已经在200mn以下，就绝不能再向小波

长方向调动，否则将损环仪器！

3.手工调动波长时应当无异声、手感轻滑，如果调动波长时有异声而且手感沉重，

则表示仪器有故障，应立即报告者师进行及时处理！

4.如果波长显示窗下面的一H.T.ALARM灯亮，请找老师！

②测定待测样品的吸光度或透光率：

样品池中注入叶绿素提取液（约2/3高度），用蒸镭水（代替丙酮）作参比，样品与参比

池都放入样品室中，盖好样品盖，测定叶绿家丙酮提取液在663nm与645nm的吸光度或

透光率，以便计算其浓度。记录数据：

叶绿素丙酮提取液663nm与645nm的吸光度,。

1.3测定样叶绿素提取液500—700nm的吸收光谱：

用蒸储水（代替丙酮）作参比，测定叶绿索提取液的吸收光谱，扫描范围500—700nm。

①设置分光光度计的扫描起点，即波长扫描范围的高限为700nmo

②调节记录仪：

⑴将记录仪上的DRIVE（走纸）开关置于“关”的位置（小点的反方向）。利用PENLEFT（抬

笔）拨秆抬起记录笔。

（2）调节记录仪光度的机械零点：打开记录仪的电源开关后，首先将CHECK/MEAS开关

拨向CHECK,再用POSITION钮将记录笔调到记录纸的某一位置（如左边基线），作为记

录仪光度的机械零点。

（3）调节记录仪光度的满度，使记录仪读数与分光光度计相同：

（A）将CHECK/MEAS开关拨向MEAS.

（B）分光光度计光路置空后调节100%

（。用主机左测面的REC.SPAN钮将记录笔调整到100%线。

（4）设置记录光谱的纵（光度）座标：依据分光光度计已定的RANGE钮，参照小实验指导的附

录表2,将记录仪的RANGE钮调到所需的位置，本次实验用1档，因此记录光谱的纵（光度）

座标为0—100%。

（5）设置记录光谱的横（波长）座标：参照本实验指导附录表1,利用主机上的SCANSPEED

钮选择扫描速度，利用记录仪上的SPEED钮选择走纸速度，三者结合设置记录光谱的（横波

长）座标.本次实验要求样品400—700nm的光谱图画在15cm宽的记录纸上，以此设置分光

光度计的参数，予习实验时设计好：

主机扫描速度：，记录仪走纸速度_____o

（6）设置记录纸上的（波长）扫描起点:将记录仪上的CLUTCH（走纸离合器）拔秆拨至OFF后，

用REWIND钮将记录纸调到合适的位置（如某一刻度线），将CLUTCH拔杆拔回ON,利用

PENLEFT（抬笔）拨秆放下记录笔。

③将盛有样品的比色池送入光路，盖上样品室盖.将主机上的SCAN（扫描）开关投向CN开

始扫描，当波长显示到达扫描终点（400nm）时，将SCAN开关投向OFF,并抬起记录笔。

2.双光束分光光度计的检查、校正与使用；

开始实验前先按1.1与1.2使仪器进入准备状态、校正零点与校正满度后，才能开始下面

的实验！

2.1.波长精度和单色光带宽检查：

2.1.1.利用苯蒸汽的吸收线检查紫外区：

11

液态的苯由于分子之间的相互作用，使其光谱的细节消失，形成一个宽带的包络，不宜用

于波长精度的检查。气态的苯分子之间作用可以忽略，其分子光谱上迭加的振动光谱细节可

以分辨，因此可以用于光谱仪波长精度的检查.方法是，将一滴苯涵入比色池，盖上盖子后

(由于苯的蒸发，比色皿中充满了苯蒸汽)再放入光路，然后按1.3节的步骤测定苯蒸汽的

吸收光谱。

测量条件；

主机扫描范围：270—240mn

主机量程(RANGE)：A0-2主机扫描速度；50nm/min

记录仪量程(RANGE)：X2记录仪走纸速度；100mm/min

思考；按本参数群的设置，所记录光谱图的横坐标和纵坐标的标尺是什么？

记录数据：

用苯蒸汽检查紫外波段的波长精度:

标准(NM)247.1252.9258.9

实测(NM)

误差(NM)

2.1.2.利用笊灯的656.Inm谱线检查可见光区：

灯是一种放电灯，在紫外区具有波长连续的发射光，常用于分光光度计紫外谱区的光源;

在可见谱区具有一系列分离的窄带谱线，本实验用笊灯656.Inm的谱线同时检查分光光度

计的波长精度和带宽，因为笊灯是一般分光光度计的常用光源，其谱线波长的精度高，作为

标准谱线用于检查分光光度计，效果很好。因此本方法是高精度分光光度计检查程序中最常

用的方法。本方法操作要点是：

(1)在可见谱区内将笊灯的656.Inm谱线的光引入光路，因为分光光度计的气灯是作为

紫外光源的，因此这一步的操作与正常测定使用有所不同。

(2)在单光束测定能量的状态下进行本项检查(思考：分光光度计的量程应放于透过率还

是吸光度?)。

(3)必需退出打拿极负反馈的状态(思考：在打拿极负反馈状态卜能否进行本检验?卜

(4)为了提高检验的精度波长扫描速度应放慢，记录仪定纸速度应稍快。实现上述操作

要点的实验步骤如下；

①将主机后部灯室右侧的光源选择拨杆拔至D2,样品室中不放比色池；

②将主机正面的上RANGE钮转至0—100%：

③将主机右边的SCANSPEED钮转至MANUAL：然后才能用手工转动主机的波长调

节旋钮，将波长调至扫描起点(660NM)(注意：只有先将SCANSPEED钮转至MANUAL,然

后才能用手工转动波长，否则将损坏仪器!)

④将主机右边的SCANSPEED钮调至50nm/min；

⑤记录仪的RANGE钮调到xl、走纸速度(SPEED)钮调到100mm/min；(思考：④、

⑤两步所设置的检坐标标尺是怎样的?)。

⑥先检查样品室盖是否盖好(这一步很重要.从现在起至步骤2.1结束，绝不可打开样

品室盖，以免损坏仪器！)；

⑦然后才能将主机左例的一H.T.AUTO/MANUAL开关拨向MANUAL(此时打拿极负

反馈巳取消，因此绝对不可再打开样品室盖，以免光电倍增管因进光而损坏!)

⑧将主机前方右侧的SCAN开关拨至ON开始扫描，待波长到达扫描终点(650nm)时，

将SCAN开关拨回至OFF。

⑨将主机左侧的一H.T.AUTO/MANUAL开关拨1口1AUTO(这一步重要)

⑩记录数据：

12

可见光波段波长精度和单色光带宽(用D?灯检查)

标准(nm)实测(nm)误差(nm)带宽(nm)

2.2.吸光度的正确度检查：

作吸光度准确性检查的标准样品应在需检查的谱谱区内具有合适的吸收强度，且是吸

光度稳定不易变化的试剂，本实验用卤玻璃片作为标准物，按1.2步骤测定标准物佗吸光

度。测量范围50()〜820nm,(思考；在双光束分光光度讦作单点波长吸光度测定时，是否需

要每个波长点都用参比校正满度?)。

记录数据:

波长(nm)513530573586685739748807.6

标准吸光度0.430.642.012.570.201.211.011.67

实测吸光度

平均吸光度误差为：ABS;标准差为：ABSo

2.6.关机顺序：

①关记录仪POWER开关。

②关电源的一H.T.开关。

③关电源的D2开关

④关电源的W开关。

⑤关电源的POWER开关。

五、实验报告内容：

1.列出实验数据，按实验中对UV--190分光光度计所作的各项性能检查的结果，对被

检查的分光光度计作一个技术状态的结论。

2.由实验所测得的叶绿素提取液在663和645nm的吸光度，根据原理中列出的公式(1),

(2)计算样品中叶绿素a,b的含量及a,b含量的比值。并与上一个实验中在72型分光光度

计(单色光带宽约20nm)上测定同一样品的结果相比较，这些值哪些是准确的?那些值的误差

较大?为什么？

附录UV—190双光束分光光度计说明

UV—190分光光度计是日本岛津公司生产的光学平衡式、双光束扫描分光光度计，工

作谱区为190—800n2n,在全谱区内单色光带宽为2nm。

UV—190双光束分光光度计的基本结构包括三部分：电源、分光光度计主体与记录仪,

电源部分提供分光光度计主体的光源与电路所需电源：主体部分包括光源、单色器、样品室、

检测器、数字显示器及整机控制与数据处理的电路；记录仪用于和主机同步扫描时绘制光谱

图。

13

7

主

机

俯

视

图

2016

3°O

O30

36。3

记

录

O3

仪

0U39俯

视

33图

。33

••3

主

机

左

视

图

O1电

源

O2

面

OOOO板

6543图

14

下面分别介绍这三部分的控制钮与键：

1.POWERFUSE电源保险丝4

2.POWERLAMP电源指示灯

3.POWERSWITCH电源开关：为电源的总开关；

4.一H.T.SWITCH负高压开关：为光电倍增管负高压电源开关；

5.WSWITCH铝灯开关；分光光度计中鸨灯的开关；

6.D2SWUTCG岚灯开关：紫外光源(笊灯)的开关，该开关可以拨向上、中、下三个

位置，在中间位置是关闭，向下和向上拨时分别为预热与点燃笊灯。点燃笊灯时先把开关向

下拨，预热十秒钟左右后再迅速向上拨。关闭时把开关拨向中间位置。主机右侧面板上的控

制钮与键：

7.LAMPSELECTOR光源选择拨干：用于选择用铝灯还是笊灯的光源入分光光度计。

8.SCANSPEEDSELECTOR扫描速度选择开关：本开关有三个位置，在中间位置时波

长可以用手动调节波长调节钮以改变波长；另两个位置是用于选择自动扫描时的两种波长扫

描速度(50nm/min与200nm/min)。

9.WAVELENGTHKNOB波长调节钮；用于手工调节波长值。主机正面板上的控制钮与

键门

10.DIGITALMETER数字表：用于显示分光光度计吸光度或透过率。

11.RANGESWITCH量程开关：用于改变光度计的量程，可用于吸光度或透光

率标尺的扩张。

12.ABS0(100%T)ADJKNOB吸光度调零钮：用于调节透过率100%或吸光度0。

13.CONCSETKNOB浓度设定钮：用于直接测定样品浓度时用。

14.一*H.T.WARNINGLAMP负高压报警灯；光电倍增管电压超过上限时此灯点燃报

警。

15.WAVELENGTHCOUNTER波长指示，指示单色器输出单色光的波长，

16.SCANSWITCH扫描开关：开始或停止波长扫描。

17.HOLDBUTTON锁定按钮：按此钮可以保持光度计显示的值、

18.PRINTBUTTON打印按钮：若接上打印机则按此钮时打印机打印光度计的值。

19.SAMPLECOMPARTMENT样品室：参比样品和持测样品放在样品室内，当负高压

为手动调节时(一H.T.为MANUAL时)不能打开样品室盖；

20.CELLSELECTORKNOB样品架推干；用于切换待测样品。

21.SAMPLECOLLHOLDER样品池架：待测样品池放入此架；

22.REFERENCECELLHOLDER参比池架：参比样品池放入此架；

主机左侧面板上的控制钮与键：

23.ZEROADJUSTER透光率调零钮，用于调整透光率零点；

24.SHIFTADJUSTER偏移调节粗调钮：本键用于纵坐标的平移(零点移动)，即在实际

的吸光度上加上某一定值使光谱曲线在纵坐标上发生平移。

25.SHIFTADJUSTER偏移调节细调钮：见上；

26.RESPONSE响应速度：分为快(FAST)、慢(SLOW)两档，用于改变记录笔达到分光

光度的输出值所需要的时间，响应速度需要和扫描速度相对应，扫描速度快时相应速度也必

须快，否则因为记录笔跟不上扫描速度而发生蹬踪误差，一般应把相应速度放了快的位置

相应速度慢时可用于降低噪声；

27.-H.TADjUSTER负高压调节钮：此钮和下一钮联用，当下；钮放于手动调节光电

倍增管负高压时用此钮调节负高压的大小，但此钮应特别小心，这是因为光电倍增管为手动

调节时打拿极负反馈已被取消，因此若负高压值调得很大时若此时打开样品室盖就会损坏光

15

电倍增管；

28.H.T.AUTO/MANUALSELECTOR光电倍增管负高压自动/手动选择开关；

负高压为自动（AUTO）时，光电倍增管的负高压（一1T.）接上打拿极负反馈，即光电

倍增管所接收信号越强时，由负高压，使打拿极负高压越低，所以对光电倍增管有一定保护

作用；负高压为手动（MANUAL）时，打拿极负反馈被取消，此时绝不能打开样品室盖，以免

光电倍增管被烧毁。因此该钮一般应放于光电倍增管负高压自动控制。

29.RECORDERSPANADJUSTER记录仪跨度调节钮：用此钮调节使分光光度计

读数与记录仪的指示相一致；

记录仪面板上的控制钮与键：

30.POWERSWITCH电源开关：记录仪的总电压开关；

31.CHARTREWINDKNOB走纸旋钮当走纸离台器为分离时用此钮可以把记录纸退回去；

32.CHARTDRIVESWITCH走纸开关：当总电源开关为接通时，此开关可控制记录

纸的驱动电机，190分光光度计有一条自动信号线，当此线与记录仪接通时，分光光度计波

长扫描开关接通时可以自动控制记录仪的走纸电机，此时本开关就失效了；

33.CHANTSPEEDSELECTOR走纸速度选择开关：用于改变记录纸走纸速度，此选

择开关与分光光度计的扫描速度合在一起决定了光谱图横坐标（波长坐标）的标尺，可乐于波

长标尺的扩张。下表是上述两种钮不同组合时光谱图上每厘米包含的波长nm数：

附录表1设置记录光谱的横（波长）座标（nm/cm）

记录仪走纸速度分光光度计扫描速度

200nm/min50nm/min

400mm/min5nm/cm1.25nm/cm

200(20)10(100)2.5

100(10)20(200)5

50(5)40(400)10

258020

12.516040

34.CLUTCHDEVER走纸离合器：当离合器脱离时记录纸与驱动甩机脱

35.PENLIFTER抬笔拨干，用于抬起记录笔，使记录笔不再在记录纸上画图

36.CHECKSWITCH检查开关；本开关向下拨时记录仪的输入端短接在地线可用于调

节零点。

37.ZEROPOINTADJUSTER记录笔调零纽：上面（36）的开关向下拨时可用此犍调节

零点。

38.RANGESELECTOR量程选择开关：用于改变记录仪的量程，此量程选择开关与分

光光度计的量程选择开关结合可以用于设置记录光谱的纵坐标（光度坐标）的标尺，

见下表。

附录表2设置记录光谱的纵（光度）座标

分光光度计记录仪量程

量程

XIX2X5xioX20

0—100%0—100%0-50%0—20%0-10%0—5%

o—3ABS0—3ABS0—1.5ABS0—0.6ABS0—0.3ABS0—0.15ABS

0—20—20—10—0.40—0.20—0.1A8S

0—0.20—0.20—0.010—0.040——0.020—0.01

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实验三多组份混合物的分光光度法定量分析

一、实验目的

学习多组份混合物分光光度法定量分析的原理和方法

二、实验原理

分光光度法定量分析的基础是比尔定律，如果样品口只有一种吸光物质，而且服从比尔

定律，则只要测定该物质的吸收光谱，选出适当的波长，并测出未知液及一个或儿个标准溶

液在该波长的吸光度，便可求出未知样中分析物的浓度。如果样品中含有数种吸光物质，则

须根据具体情况分别处理。

若样品中各吸光物质之间无相互影响且吸收带q不重叠，则可在各自的最大吸收波长位

置分别测定，这与单分样品的测定完全一样。

若样品中各吸光物质的吸收曲线相互重叠，进行定量分析的方法有；

1.公式法：根据吸光度加和性原