棉花生理指标测定方案样本

一谷胱甘肽还原酶(GR)活性

一、材料、仪器设备及试剂

(-)材料

棉花

(二)仪器设备

研钵，高速冷冻离心机，紫外分光光度计，试管数支。

(三)试剂

(1)0.1M(pH7.5)磷酸缓冲液(PBS,含1%PVP);0.2mMEDTA;1.5mMMgC12;0.025mMNADPH;

0.25mM氧化型谷胱甘肽(GSSG)

二、实验步骤

1、酶液提取

取1g棉花叶片于预冷的研钵中，加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成奖，加缓冲液

使终体积为5mlo取5ml于1r/min下离心20min,上清液即为GR粗提液。

2、显色反应

取透明度好、质地相同的15nmiX150mm试管4支，2支为测定管，另2支为对照管。

按下表加入各种溶液：(测定时按表格中各溶液的量加倍，以便于重复测定两次。)

显色反应试剂配制表

试剂名称用量(ml)

0.lmol/L磷酸缓冲液(PBS)0.2

1.5mmol/LMgC120.1对照2支管不加酶液

0.2mmol/LEDTA0.1

0.025nimol/LNADPH0.2

0.25rnM氧化型谷胱甘肽(GSSG)0.2

酶液0.2

蒸馀水2

总体积3

混匀后比色，3min内每30s记录一次数据

三、结果计算

GR总活性=(A(1-AJG%/(A。X0.5XF//XV.)

式中：GR总活性以酶单位每克鲜重表示；

Ao——为照光对照管的吸光度；

A.——为样品管的吸光度；

VT一一为样品液总体积ml;(5ml)

V.——为测定时样品用量ml;(0.2ml)

FW-为样品鲜重g;(：g)

二H202含量测定

二、仪器与用具

分光光度计、离心机、研钵、5mli支，容量瓶10n】17个、移液管0.2ml,离心管5ml

8支

三、试剂及其配制

(1)100uMH202丙酮试剂:取30%分析纯H20257ul,溶于100ml丙酮中,此液稀释100倍。

(2)2M硫酸

(3)丙酮

(4)浓氨水

(5)5%(W/V)硫酸钛

(6)0.3%H。:吸取0.5ml30%用50mmol/L(PH7.0)的磷酸缓冲液(PBS)定容至50ml。

四、方法

1标准曲线制作取10ml离心管7支，顺序编号，按表加入试剂

试剂离心管号

1234567

H20200.10.20.40.60.81.0

4°C预冷丙酮1.00.90.80.60.40.20

5%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1

浓氨水0.20.20.20.20.20.20.2

3000r/min离心lOmin,弃去上清液，留沉淀

2mol硫酸5.05.05.05.05.05.05.0

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10nd容量瓶，蒸储水冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至

10ml,415nm下比色。

2样品提取和测定

（1）称3g,按材料和提取剂1:1的比例加入4°C下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆，转

入离心管3000r/min下离心lOmin,弃去残渣，上清液即为样品提取液。

（2）用移液管吸取1ml上清液，按表加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000r/min下离

心lOmin,弃去上清液。沉淀用丙酮重复洗涤5次，直到去除植物色素。

（3）向洗涤后的沉淀中加入2moi硫酸5ml,待完全溶解后，转入10ml容量瓶中，用蒸储水

冲洗离心管，定容至10ml,415nm下比色。

3结果计算每克鲜重植物组织中H202含量（umol/g）=C*Vt/FW*Vl

式中C——标准曲线上查得样品中H202浓度（umol）

Vt一一样品提取液总体积（ml）

VI—测定时用样品提取液体积（ml）

FW——植物组织鲜重（g）

三乙醇脱氢酶（ADH）活性测定

二、仪器与用具

分光光度计、离心机、研钵，容量瓶，离心管

三、试剂

（1）lOOmMHEPES

（2）50mM三羟甲基氨基甲烷（Tris-Hcl）缓冲液（PH8.0）

(3)15mM二硫苏糖醇(DTT)

(4)20%乙醇

(5)0.867mM氧化型辅酶1(NAD)

1、酶液提取

称棉花叶片0.1g,加2mlHEPES溶液，ImlDTT研磨成匀浆，转移到离心管中，10000

r/min下离心15min。上清液即为ADH粗提液。

2、ADH活性测定

在3ml反应体系中包括：(1)在MmTris-Hcl缓冲液:1ml

(2)20%乙醇:0.5ml

(3)15mMDTT0.45ml

(4)0.867mMNAD1ml

(5)酶液：50ul(对照加入50ul缓冲液代替,调零)

在340nni波长下测定吸光度，每隔30s读数一次，共测4min。

3、结果计算

ADH活性二△0D340*Vt/Vs*0.01*t*FW(酶活性单位为:U/(g•min))

U:酷活单位(将每分钟0D减少0.01定义为1个活力单位)

△Az」。：反应时间内吸光度变化；

t:为反应时间(min);(3min)

匕:提取酶液的总体积(ml)；(3ml)

Vs：测定时取用酶液体积(ml)；(0.05ml)

FW:0.lg

四抗坏血酸过氧化物酶(AsA-POD)活性测定

一、仪器

高速冷冻离心机、紫外分光光度计、研钵、试管。

二、试剂及配置

(1)50mmol/L(PH7.0)的磷酸缓冲液(PBS):取61mlA母液+39mlB母液+蒸播水定容到

400mlo(母液之前配好)

(2)提取液——50mmol/L(PH7.0)的磷酸缓冲液,含2mmol/LAsA和0.Immol/LEDTA—Na2。

配置方法：①取61mlA母液+39mlB母液+蒸储水定容到400ml;

②称取0.1409g的AsA溶到PBS中;

③称取0.0148896g的EDTA—Na?溶到PBS中。

(3)0.3mmol/L的AsA溶液：(配100ml)

配置方法：A法：直接称取0.052839g的AsA,用50mmol/L(PH7.0)的磷酸缓冲液定容到

100ml©

B法：①先配置0.3mo"L的AsA母液:称取5.2839g的AsA配置1L的母液。

②取1ml0.3mol/L的AsA母液用50nmol/L(PH7.0)的PBS定容到100ml。

(4)0.2%H202:用移液抢吸取667同的30%HM用50mmol/L(PH7.0)的PBS定容到100ml。

(AsA的相对分子质量为：176.13;EDTA—N&的相对分子质量为:372,24)

三、方法步骤

1、酶液的提取

称取0.5g叶片，按1:5加入预冷的提取液，在冰浴中研磨后，在4500r/min下离心

15min,上清液为粗酶提取液。(研磨时加2.5ml,洗钵再加2.5ml,提取液共5ml.)

2、酶活性测定

反应体系如下：①50mnol/L(PH7.0)的PBS:1.8ml;

②0.3nmol/L的AsA溶液：100^1;

③粗酶提取液：100R;(对照加提取液代替，调零)

©0.2%H202:1ml;

加入后立即在290nm波长下测定4min内0。2例)值的变化，计算酶活性。

3、结果计算

AAx\7

AsA・