细菌耐药机制专题医学知识宣讲

细菌耐药机制研究进展

浙江大学医学院从属第一医院俞云松细菌耐药机制专题医学知识宣讲1/82细菌耐药机制专题医学知识宣讲2/82细菌耐药机制专题医学知识宣讲3/82一、外膜孔蛋白降低或丢失细胞内抗生素浓度降低膜孔蛋白(OprD):

细菌耐药机制专题医学知识宣讲4/82细胞外膜上一些特殊蛋白是一个非特异性、跨越细胞膜水溶性物质扩散通道。膜孔蛋白细菌耐药机制专题医学知识宣讲5/82革兰阴性细菌细胞膜细菌耐药机制专题医学知识宣讲6/82一些细菌本身存在膜孔蛋白较少或蛋白通道较小，使一些抗菌药品不能进入菌体内部，称为“内在性耐药”或“固有性耐药”（intrinsicallyresistant)，即这种耐药并非是因为任何染色体突变或是耐药质粒取得所致。如铜绿假单胞菌细胞外膜上没有大多数革兰阴性细菌所含有经典高渗透性孔蛋白，它孔蛋白通道对小分子物质渗透速度仅为经典孔蛋白通道1%。

"先天不足”细菌耐药机制专题医学知识宣讲7/82一些含有高渗透性外膜且反抗菌药品敏感细菌能够经过降低外膜渗透性而发展成为耐药菌,即原有孔蛋白通道因为细菌发生突变而使该孔蛋白通道关闭或消失,则细菌就会对该抗菌药品产生很高耐药性。亚胺培南是一个非经典β-内酰胺类抗菌药品,主要是经过一个特殊孔蛋白通道OprD2扩散进入细菌,一旦这一孔蛋白通道消失,则产生耐药性。"后天取得”细菌耐药机制专题医学知识宣讲8/82产气肠杆菌从亚胺培能敏感株变为耐药株细菌耐药机制专题医学知识宣讲9/82亚胺培南敏感及耐药产气肠杆菌PFGE图C1C2:亚胺培南敏感C3C4:亚胺培南耐药细菌耐药机制专题医学知识宣讲10/82亚胺培南敏感及耐药产气肠杆菌SDS图C1C2:亚胺培南敏感C3C4:亚胺培南耐药细菌耐药机制专题医学知识宣讲11/82PCR扩增Omp36全长及序列分析IS90398%(约1000bp)细菌耐药机制专题医学知识宣讲12/82插入序列引发OprD2缺失（铜绿)ISPa1328约bpOprD2细菌耐药机制专题医学知识宣讲13/82细菌产生一个或各种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细胞内抗菌药品，使之抵达靶位之前失去活性细菌产生灭活酶主要有:β-内酰胺酶氨基糖苷类钝化酶氯霉素乙酰转移酶MLS钝化酶二、产生灭活酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲14/82超广谱-内酰胺酶（ESBLs）高产AmpC酶碳青霉烯酶最主要耐药原因对

-内酰胺抗生素造成威胁

-内酰胺酶临床上最主要-内酰胺酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲15/82是质粒介导能够水解头孢他啶、头孢噻肟等亚氨基β-内酰胺类及氨曲南等单环酰胺类抗生素,并可被克拉维酸等β-内酰胺酶抑制剂所抑制一类β-内酰胺酶。ESBLs在分子生物学分类中属于A类酶,在Bush分类中属于2be类酶。超广谱-内酰胺酶（extended-spectrum-lactamases，ESBLs)细菌耐药机制专题医学知识宣讲16/82ESBLs分类依据基因同源性不一样分为:TEM型80SHV型46CTX-M型37OXA型18其它型20/studies/webt.htm.CTX-M-1组CTX-M-2组CTX-M-8组CTX-M-9组细菌耐药机制专题医学知识宣讲17/82中国400株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌基因型分布细菌耐药机制专题医学知识宣讲18/8232家医院1994-

大肠杆菌及肺炎克雷伯菌产ESBLs百分率细菌耐药机制专题医学知识宣讲19/82头孢菌素酶

大部分肠杆菌科细菌如肠杆菌属菌种、弗劳地枸橼酸杆菌、摩根摩根菌、普鲁菲登菌属菌种粘质沙雷菌等都能产生染色体介导AmpC酶。细菌耐药机制专题医学知识宣讲20/82

阴沟肠杆菌细菌耐药机制专题医学知识宣讲21/82ACT-1,DHA-1,CMY(Peking)DHA-1,CIT,ACT-1(Shanghai)

DHA-1(Zhejiang)DHA-1,ACT-1(GuangZhou)DHA-1isThePredominantTypeinChinaMapofChina细菌耐药机制专题医学知识宣讲22/82克隆片段PCR产物1100bp共6432bp

ORF1ORF2ORF3ORF4ORF5ORF6IS26orf-1

DHA-1ampRqacE⊿1sul15232bp细菌耐药机制专题医学知识宣讲23/82指全部能显著水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素一类β内酰胺酶分别属于Ambler分子分类中A类、B类、D类酶。碳青霉烯酶

细菌耐药机制专题医学知识宣讲24/82天然起源碳青霉烯酶嗜麦芽寡养单胞菌L1酶取得性碳青霉烯酶（Ambler分子分类）B类酶（金属酶）：IMP、VIM类及SPM-1A类酶：NMC-A.KPC-1、GES-2等D类酶：OXA-23至OXA-27、40、48、54碳青霉烯酶按其起源可分为细菌耐药机制专题医学知识宣讲25/82金属酶染色体编码金属酶:BCⅡ，L1,TUS-1,MUS-1,Sfh-1,Mbl1b，大多起源于环境寄生菌。取得性金属酶:IMPVIMSPMGIM-1SIM-1，位于可转移基因元件上，造成区域性传输。细菌耐药机制专题医学知识宣讲26/82IMP型金属酶IMP型金属酶GenBank上已公布21种，比较它们相互之间序列表明：IMP型金属酶大致能够分为两组：1）IMP-1、IMP3-7、IMP9－11、IMP-162）IMP-2和IMP-8、12、13.19、20细菌耐药机制专题医学知识宣讲27/82中国IMP-4年香港鲍曼广州杨格枸橼酸杆菌、铜绿IMP-1年12月江苏无锡铜绿IMP-8台湾铜绿细菌耐药机制专题医学知识宣讲28/82VIM型金属酶VIM型金属酶与IMP类金属酶同源性40％，但两类金属酶动力学性质相同，编码基因都位于整合子上。当前VIM型金属酶GenBank上已公布12种，比较它们相互之间序列可将VIM金属酶大致分为三组：1）VIM-1、4、5.11a2）VIM-2、3、6、8、9、10、11b3）VIM-7细菌耐药机制专题医学知识宣讲29/82VIM型金属酶分布VIM-11999年意大利

铜绿氧化木糖产碱杆菌恶臭假单胞

－希腊

大肠肺克

法国肺克VIM-2法国

铜绿

意大利希腊日本韩国葡萄牙西班牙波兰克罗地亚智利阿根廷美国中国VIM-3年台湾地域

铜绿VIM-4年希腊

铜绿

瑞典

铜绿意大利

肺克阴沟

波兰铜绿细菌耐药机制专题医学知识宣讲30/82VIM-5土耳其肺克铜绿VIM-6新加坡恶臭假单胞VIM-7美国铜绿VIM-8哥伦比亚铜绿VIM-9,10英国VIM-11阿根廷意大利VIM型金属酶分布细菌耐药机制专题医学知识宣讲31/82亚胺培南耐药铜绿假单胞菌金属酶检测结果北京（27）上海（32）杭州（27）广州（32）成都（22）金属酶表型阳性菌株数35310百分率11.1％15.6％11.1％3.1％0.0％金属酶基因型阳性菌株数36410百分率11.1％18.8％14.8％3.1％0.0％细菌耐药机制专题医学知识宣讲32/82

VIM-2基因整合子结构图A：B2，B3，B28，H19，H26，H54，G4结构同In72B：S5，S9，S10，S11，S12（S15.H22除外）

intI1attI1aacA459-bVIM-259-beaadB59-be3’-CS

intI1attI1aacA459-beVIM-259-be3’-CSAB细菌耐药机制专题医学知识宣讲33/82H22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54Marker50kbABH22H26g4s5s9s10s11s12s15b2b3b28w19w54MarkerPFGE谱分析结果：共有七种类型，来自上海六株为同一类型，来自北京三株分两个类型，来自杭州四株一样也分两个类型。各地域之间类型各不相同。重复尝试经过接合试验及质粒抽提物电转化传递金属酶基因均未获成功。经XbaI内切酶消化染色体PFGE与VIM-2探针杂交显示其中10株铜绿假单胞菌50-kb大小酶切片段杂交阳性，而其余3株（H22.H26、B2）没有阳性片段。细菌耐药机制专题医学知识宣讲34/82Ａ类酶包含阴沟肠杆菌、粘质沙雷菌中由染色体介导NMC-A.Sme-1～Sme-3、IMI-1酶，以及肺炎克雷伯菌中质粒介导KPC-1-4酶、铜绿假单胞菌中质粒介导GES-2酶。碳青霉烯类抗生素水解酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲35/82二株产IMI-1阴沟肠杆菌PFGE结果细菌耐药机制专题医学知识宣讲36/82AntibioticsMIC(mg/l)EcloacaeEC600

E.coliC600E8

E.coliDH5

E.colipT103Imipenem≥320.38≥320.25≥32Ciprofloxacin0.0640.250.250.006008Amikacin4220.250.38Cefepime20.0640.0640.1250.047Ceftazidime160.50.380.50.25Cefotaxime120.050.1250.0940.047Cefoperazone≥2560.51.50.0474Cefoperazone/Sulbactam1280.25262Piperacillin/Tazobactam≥2562424Ticarcilliin/ClavulanicAcid≥2561232432Ampicillin/Sulbactam≥2568641.5NDEcloacae8,EC600,E.coliC600E8,E.colipT103和E.coliDH5反抗菌药品体外抗菌活性细菌耐药机制专题医学知识宣讲37/82阴沟肠杆菌、接合菌质粒电泳图谱

M1ABM2

54kb15kb细菌耐药机制专题医学知识宣讲38/82SchematicrepresentationoftheclonedE.coRⅠfragment

IS903IMI-2Imi-2RIS903IS2903bp921bp882bp876bp921bp10629bp(GenBankaccessionnumber:AY780889)Imi-R与ImiR同源性为97%。IMI-2与IMI-1同源性99%，仅在37位由天冬氨酸→天冬酰胺，106位由组氨酸→酪氨酸细菌耐药机制专题医学知识宣讲39/82抗菌药品肺炎克雷伯菌亚胺培南>32亚胺培南/克拉维酸16美罗培南>32美罗培南/克拉维酸16厄他培南>256头孢他啶>256头孢他啶/克拉维酸>256头孢噻肟>256头孢噻肟/克拉维酸>256头孢吡肟>256头孢曲松>256头孢西丁>256氨曲南>256头孢哌酮/舒巴坦>256哌拉西林/三唑巴坦>256环丙沙星>32阿米卡星>256多重耐药肺炎克雷伯菌细菌耐药机制专题医学知识宣讲40/82转化试验抽提亚胺培南耐药肺炎克雷伯菌质粒转化DH5α，在含1g/ml亚胺培南MH平板上筛选成功筛选到亚胺培南耐药转化菌（转化质粒约60kb)染色体带61kb细菌耐药机制专题医学知识宣讲41/82PCRPCR筛选β内酰胺酶耐药基因包含TEM-1.SHV、CTX-M-1.CTX-M-9、OXA-48、VIM、OXA-10和KPC-1以肺炎克雷伯菌质粒DNA为模板PCR阳性为TEM、SHV和KPC转化菌和克隆菌只有KPC阳性PCR产物测序分别为TEM-1.SHV-12和KPC-2细菌耐药机制专题医学知识宣讲42/82转化菌质粒（亚胺培南耐药基因克隆)EcoRІ,HindⅢ,NheІ等酶切NheІpTeasyVectorpTeasyVector1.5kb在含亚胺培南1

g/mlMH平板筛选细菌耐药机制专题医学知识宣讲43/82克隆片段测序对重组质粒插入片段进行步移测序，取得1554bp核苷酸DNAssist软件分析，1个开放读码框(ORF)经GenBankBlast程序分析，该ORF与KPC-2(

GenBank注册号:AY210886)核苷酸序列同源性为100%细菌耐药机制专题医学知识宣讲44/82D类酶（OXA酶)在Bush分群中属于2d类，对苯唑西林水解活性很强。OXA型碳青霉烯酶对亚胺培南水解活性较低，对头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南水解活性也很弱。除OXA-23外，其它酶能被三唑巴坦、克拉维酸抑制。OXA型碳青霉烯酶编码基因可位于质粒或染色体上，或定位在I型整合子基因盒中，具备向其它菌种转移能力碳青霉烯类抗生素水解酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲45/82blaOXA-23-like,blaOXA-51-like是我国鲍曼不动杆菌最主要碳青霉烯酶,

ISAba1与OXA基因表示和转移亲密相关342株亚胺培南耐药鲍曼不动杆菌中339株检测到最少一个OXA基因，303株检测到OXA-23-like和OXA-51-like基因，22株只检测到OXA-23-like基因，17株只检测到OXA-51-like基因;其中在313株菌株OXA-23-like基因上游34bp处检测到ISAba1，在13株菌株OXA-51-like基因上游7bp处检测到ISAba1。细菌耐药机制专题医学知识宣讲46/82氨基糖苷类钝化酶分为：

磷酸转移酶（APH)乙酰转移酶（AAC)核苷转移酶（ANT)氨基糖苷类钝化酶作用机制：

三者分别使抗生素羟基磷酸化、氨基乙酰化和羟基核苷化，使之不能再与细菌核糖体结合。氨基糖苷类耐药细菌耐药机制专题医学知识宣讲47/82庆大霉素高水平耐药（HLGR)

主要耐药机制氨基糖苷类修饰酶耐药基因百分率AAC(6’)-Ie-APH(2’)-Iaaac(6’)-Ie-aph(2’)-Ia＞90%APH(2’)-Icaph(2’)-IcAPH(2’)-Idaph(2’)-IdAPH(2’)-Ibaph(2’)-Ib＜10%氨基糖苷类耐药细菌耐药机制专题医学知识宣讲48/828,724bpORF1ORF2ORF4

ORF35’3’ISEcp1(tnpA)

aph-Ie

repD

str部分序列

一个新质粒介导肠球菌氨基糖苷类耐药基因aph(2")-Ie细菌耐药机制专题医学知识宣讲49/82三、靶位改变细菌耐药机制专题医学知识宣讲50/82主要抗菌药品作用靶位

-内酰胺类青霉素结合蛋白（PBP)氨基糖苷类

核糖体30S亚基大环内酯类

核糖体50S亚基氟喹诺酮类DNA旋转酶（拓扑异构酶Ⅱ)、拓扑异构酶Ⅳ糖肽类D-丙氨酰D-丙氨酸四环素类

核糖体50S亚基

细菌耐药机制专题医学知识宣讲51/82PBP2a作用PBP2a与β-内酰胺抗生素亲和力低,替换正常PBP功效87Kda——PBP1——80——PBP2——78——PBP2a75——PBP3’——70——PBP3——41——PBP4——细菌耐药机制专题医学知识宣讲52/82细菌耐药机制专题医学知识宣讲53/82细菌耐药机制专题医学知识宣讲54/82DRIRIRDRSCCmecccrAccrBmecImecR1mecAorfXJ1J3J2SCCmec细菌耐药机制专题医学知识宣讲55/82细菌耐药机制专题医学知识宣讲56/82I－V型细菌耐药机制专题医学知识宣讲57/82VSHA-MRSACA-MRSA

高耐药性较低

阴性

PVL阳性I、II、IIISCCmecIV、V细菌耐药机制专题医学知识宣讲58/82金葡菌耐药性发展历程S.aureusPenicillin-resistantS.aureusMethicillin-resistantS.aureus(MRSA)PenicillinMethicillinVancomycin-resistantenterococcus(VRE)Vancomycin(glycopeptide)-Intermediate-ResistantS.Aureus（VISA.GISA）Vancomycin-ResistantS.Aureus（VRSA)Vancomycin[1940][1960s][1990s][1996]Superbugs[]细菌耐药机制专题医学知识宣讲59/82氟喹喏酮耐药机理拓扑异构酶IV(parC,parE)拓扑异构酶II(gyrA,gyrB)左氧氟沙星氟喹喏酮细菌耐药机制专题医学知识宣讲60/82糖肽类抗生素包含万古霉素、替考拉宁等，是高分子量疏水性化合物。主要耐药机制:VRE细胞壁肽糖前体末端D-丙氨酰-D-丙氨酸发生了改变，万古霉素不能与之相结合，所以不能抑制VRE细胞壁合成。耐万古霉素肠球菌（VRE)细菌耐药机制专题医学知识宣讲61/82transposaseresolvasevanRvanSvanHvanAvanX6590bp(ZY02,HS3)表示PCR扩增vanYvanZ10Kb（ZY01)转座功效（转座酶transposase基因和解离酶revolsase基因，分别编码产生转座酶和解离酶在转座过程中发挥作用)调控耐药基因（VanR和VanS)产生耐糖肽类缩肽（VanH脱氢酶、VanA连接酶和VanX二肽酶)辅助蛋白（VanY和VanZ)含VanA基因簇转座子转座入各种质粒,或经过接合转座造成VRE耐药性传输细菌耐药机制专题医学知识宣讲62/82大环内酯类耐药机制核糖体靶位点改变:erm编码,高耐;法国、西班牙、中国主动外排泵:mef编码,低耐,加拿大、美国、修饰酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲63/8216SrRNA甲基化酶氨基糖苷类抗生素作用位点：细菌16SrRNA以往认为最主要氨基糖苷类抗生素耐药机制：修饰酶，作用位点在药品，引发一个或几个药品耐药最新发觉一类新氨基糖苷类抗生素耐药机制：16SrRNA甲基化酶，引发药品作用位点甲基化，造成细菌对全部氨基糖苷类抗生素高水平耐药，当前发觉4种：armA、rmtA、rmtB.rmtC多重耐药鲍曼不动杆菌在我国各省市广泛流行，该菌对氨基糖苷类抗生素耐药率和耐药水平高16SrRNA甲基化酶是否在介导该菌对氨基糖苷类抗生素耐药中发挥作用需要系统研究细菌耐药机制专题医学知识宣讲64/82700株鲍曼不动杆菌对5种氨基糖苷类

抗生素体外抗菌活性·5种氨基糖苷类抗生素耐药率均大于60％；·377株（53.9％)菌株对5种氨基糖苷类抗生素均耐药；·334株（47.7％)菌株armA阳性；·armA阳性菌株对上述全部氨基糖苷类抗生素均高水平耐药,MIC＞256mg/L·重复进行接合试验、质粒抽提、电转化均未成功·Southern-blot杂交证实armA基因位于克隆A、B.C约220kb、300kb、220kb大小染色体ApaI酶切条带上armA基因定位于鲍曼不动杆菌染色体细菌耐药机制专题医学知识宣讲65/82四、主动外运

有些抗菌药品（常见如四环素类及喹诺酮类)能诱导细菌主动外运，抗菌药品难以在细菌内积累到有效浓度，造成反抗菌药品耐药程度普遍提升。细菌耐药机制专题医学知识宣讲66/82外排泵结构外排系统由3个部分组成:位于内膜肿瘤耐药分化家族(resistant—nodulation—divisionfamily，RND)质膜转运体内外膜之间膜周连接蛋白或膜融合蛋白(MFP)位于外膜孔道形成蛋白(0EP)

细菌耐药机制专题医学知识宣讲67/82组间外排泵表示量均值比较细菌耐药机制专题医学知识宣讲68/82

是指细菌粘附于固体或有机腔道表面,形成微菌落,并分泌细胞外多糖蛋白复合物将本身包裹其中而形成膜状物。其生化组成为藻酸盐多糖和蛋白复合物。菌膜可阻止巨噬细胞、抗体、药品作用于菌体五、细菌生物被膜（Biofilm)细菌耐药机制专题医学知识宣讲69/82生物被膜细菌耐药机制专题医学知识宣讲70/82

细菌形成生物被膜后,往往反抗菌药品产生高度耐药性,原因有细菌生物被膜可降低抗菌药品渗透吸附抗菌药品钝化酶,促进抗菌药品水解细菌生物被膜下细菌代谢低下,反抗菌药品不敏感生物被膜存在阻止了机体对细菌免疫力,产生免疫逃逸现象,减弱机体免疫力与抗菌药品协同杀菌作用细菌耐药机制专题医学知识宣讲71/82其它耐药机制缺乏自溶酶替换路径酶过量产生等靶位保护机制细菌耐药机制专题医学知识宣讲72/82质粒介导喹喏酮耐药1998年George.A.Jacoby等从一株肺炎克雷伯菌（UAB1)中发觉能介导各种抗生素耐药质粒pMG252，经接合传递后其接合子对环丙沙星耐药性增加近30倍(MIC0.008→0.25μg/mL)。在该质粒内发觉了喹诺酮耐药（quinoloneresistance)基因，命名为qnr(Lancet1998;351:797–99)细菌耐药机制专题医学知识宣讲73/82作用机制保护DNA旋转酶Qnr经过与旋转酶特异地结合从而影响酶内在活性,降低了酶与DNA结合,造成喹诺酮类药品作用靶位数量降低Qnr与旋转酶结合,改变了药品结合区域构象,从而降低了药品识别靶位效率保护拓扑异构酶Ⅳ细菌对拓扑异构酶Ⅳ保护作用与DNA旋转酶类似Hegde,S.S.etal.Science308:1480,QnrDNA旋转酶细菌耐药机制专题医学知识宣讲74/82表5株qnrA阳性大肠埃希菌及其接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP63128256643225616212>256Tc631410.5>2564414>256140642566432322888>256Tc1401421162884>256142484162564424>256Tc1420.50.511322882>256Z8161616321284256>256>256>256TcZ80.060.060.1250.06128464>256>256>256Z11326416321284256>256>256>256TcZ110.060.060.1250.0664464>256>256>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112J53为受体菌细菌耐药机制专题医学知识宣讲75/82表38株qnrA阳性肺炎克雷伯菌及其接合菌MIC值菌株CIPNOROFXMOXCTXCAZSGENAKAMP14-264128＞64128322111>256Tc14-20.250.510.25162221>2562564256643225616422>256Tc2518121284414>256316425612812825616212>256Tc311812>2568412>2569628221282428>256Tc9618122568414>25615181684644428>256Tc1511110.25321212>256152864441282428>256Tc1520.520.50.5641414>25615332128161632>64>256>256>256>256Tc1530.5112161212>2561564821644428>256Tc1562820.25644414>256J530.0150.1250.1250.030.060.1254112细菌耐药机制专题医学知识宣讲76/82质粒DNA与PCR产物探针Southern杂交A:肺炎