临床真菌学检验基本技术培训课件

临床真菌学检验基本技术培训镜检·培养·鉴定·药敏·新技术2026年10月课程导览01检验技术筑基标本采集与镜检培养基础方法02病原识别要点常见致病真菌形态与危害03鉴定流程实操菌种鉴定与药敏试验标准流程04前沿规范展望质谱新技术与最新指南共识检验技术筑基标本质量决定检验成败从采集到镜检，打好真菌检验第一仗01标本采集是检验成败第一步标本不合格，后续全白费采集前识别合格标本用药史与送检时限决定结果可靠性采集前要点3项用药前取样采集前了解用药史，应在用药前取样2小时内送检标本应新鲜，不超过2小时送检不能立即送检须冷藏标本应新鲜，不能立即送检须冷藏各感染类型标本与关键要求感染类型常见标本关键要求浅部真菌毛发、皮屑、甲屑、痂分离前用75%乙醇消毒深部真菌痰、尿、粪便、脓液、脑脊液严格无菌操作血液与脑脊液血液、脑脊液采集量不少于5ml胸腔积液穿刺液采集量不少于20ml活体组织组织块采2份，1份送病理、1份送镜检培养直接镜检快速筛查真菌最简单也最重要的实验室诊断方法氢氧化钾法4项标本置载玻片加一滴浮载液，加盖玻片，火焰上快速通过

2至3次不可煮沸以免结晶；轻压盖玻片驱逐气泡后镜检低倍镜查菌丝和孢子再高倍镜观察形态、大小与排列适用标本皮屑、甲屑、毛发、痰、粪便、组织等复方氢氧化钾溶液3项含氢氧化钾、二甲基亚砜与甘油促进角质溶解涂片不易干、不易结晶，腐蚀性低适合大面积普查或大批量标本镜检墨汁涂片2项标本混合墨汁取一小滴墨汁与标本混合后直接镜检检查荚膜孢子用于检查隐球菌及其他有荚膜的孢子涂片染色提升检出率选对染色，真菌结构更清晰涂片固定后，按菌种选择染色方案，真菌结构更清晰基础染色方案3种革兰染色酵母菌、孢子丝菌、组织胞浆菌、诺卡菌、放线菌乳酸酚棉蓝各种真菌培养物镜检印度墨汁脑脊液中新生隐球菌特殊染色方案3种抗酸染色抗酸菌及诺卡菌瑞氏染色组织胞浆菌、马内菲青霉过碘酸锡夫染色组织切片，多数真菌染成红色培养检查确定菌种培养是深部真菌感染确诊金标准“排除细菌与其他真菌污染、区分混合感染后，对纯菌落进行鉴定。”培养基与条件常用沙保弱培养基与葡萄糖蛋白胨琼脂一般置室温或25至30℃培养1至3周深部真菌需37℃或更长时间，可达2至4周必要时行玻片小培养协助鉴定培养的价值与局限可提高检出率并确定菌种，同步进行药敏试验指导用药阳性率受标本质量、运送条件与培养时间影响，必要时重复送检鉴定依据菌落形态与显微镜下形态，必要时配合鉴别培养基、生化反应或分子方法血清学与分子检测辅助诊断非培养技术已成为诊断主力血清学与分子检测互为补充，共同提高真菌感染诊断的敏感性与特异性血清学检查4项检测真菌抗原或抗体常用酶联免疫吸附试验与免疫荧光法隐球菌荚膜多糖抗原检测对隐球菌脑膜炎特异性较高半乳甘露聚糖（GM）试验有助于曲霉感染早期诊断假阳性与假阴性需结合临床综合判断分子生物学检测3项聚合酶链反应、基因测序快速敏感检测真菌核酸特异性强、灵敏度高尤其适合难以培养或形态不典型的真菌要求高、成本高对实验室条件与操作人员要求较高，成本相对较高病原识别要点识别病原，方能精准施策念珠菌、曲霉、隐球菌，逐一拆解02常见致病真菌全景识别深部感染以念珠菌、隐球菌、曲霉为主病原真菌主要感染特点白色念珠菌皮肤、黏膜及内脏感染，免疫低下者全身播散新型隐球菌经呼吸道入侵，致隐球菌性脑膜炎烟曲霉免疫受损者侵袭性曲霉病，累及肺部毛霉菌属鼻脑型毛霉病、肺毛霉病，病情凶险组织胞浆菌吸入孢子，引起肺部或播散性感染皮肤癣菌感染皮肤、毛发、指甲，致脚气、股癣念珠菌是条件致病菌免疫下降时由定植转为致病念珠菌作为条件致病菌，平时定植于人体，只在免疫或微生态失衡时才转为致病生物学特征3项形态特征单细胞真菌，菌体卵圆形，有芽生孢子，伸长后形成假菌丝抵抗力不强，加热至60℃一小时即可死亡环境耐受对干燥、日光、紫外线抵抗力较强致病特点人体正常菌群皮肤、口腔、阴道和肠黏膜条件致病菌免疫下降或微生态失衡时转变浅层或系统感染皮肤黏膜或全身常见病症口腔炎、阴道炎、导管相关感染、念珠菌败血症最终确诊需无菌部位培养或组织病理曲霉菌与隐球菌危害大一为丝状真菌，一为类酵母菌曲霉菌多细胞丝状真菌可致严重感染广泛分布谷物、空气、土壤及有机物品常见种烟曲霉、黄曲霉、土曲霉免疫功能受损者易引起侵袭性曲霉病隐球菌类酵母菌，新生隐球菌是重要致病菌存在环境：土壤、鸽粪等鸟类粪便感染方式：孢子经呼吸道吸入，病灶初在肺部荚膜多糖是重要致病物质与确诊线索最易侵犯中枢神经系统，引发隐球菌性脑膜炎，死亡率高危害对比曲霉菌多细胞丝状真菌，可致严重感染，易侵袭免疫功能受损者隐球菌类酵母菌，最易侵犯中枢神经系统，引发隐球菌性脑膜炎，死亡率高

侵入曲霉菌经免疫力低下侵入，隐球菌经呼吸道吸入

重症均可致侵袭性感染，危害大、死亡率高毛霉等其他致病真菌少见但凶险，不可忽视毛霉菌属急性致命包括毛霉、根霉等可引起急性且致命的感染鼻脑型与肺部毛霉病病情通常较凶险糖尿病酮症酸中毒患者中较为常见组织胞浆菌吸入感染分布于土壤中的孢子吸入后可引发组织胞浆菌病通常为轻度或无症状某些情况下可致严重呼吸系统问题皮肤癣菌浅部感染如毛癣菌感染皮肤、毛发、指甲引发脚气、股癣、手足癣等浅部感染鉴定流程实操从菌落形态到药敏报告酵母菌与霉菌鉴定路径全解析03鉴定先分酵母菌与霉菌先区分类别，再鉴定到种鉴定真菌，先区分酵母菌与霉菌，再做菌种鉴定鉴定总原则3项首要区分酵母菌与霉菌明确大类归属酵母样菌落鉴定前先分类纯化避免混合干扰排除污染与混合感染后，对纯菌落鉴定确保结果可靠显色培养基与生化鉴定颜色即线索，一次判读区分菌种常用生化试验：芽管形成试验辅助生化试验菌种·菌落颜色对照菌种菌落颜色白假丝酵母菌翠绿色光滑念珠菌紫色热带念珠菌铁兰色克柔念珠菌粉红色柯玛嘉显色培养基分区划线，35℃孵育24小时观察菌落颜色显色培养基上，菌落颜色即生化鉴定第一线索，一次判读即可初步区分菌种01芽管形成试验真菌接种

0.2ml

人血清37℃

孵育白假丝酵母菌

产生芽管02辅助生化试验尿素酶测试糖发酵或利用测试等辅助区分不同真菌类别真菌药敏试验方法比较精度与效率，各有取舍四种药敏方法对比——精度与操作复杂度四种方法的原理与特点纸片扩散法：含药纸片贴平板，测抑菌圈。操作简便成本低，重复性较差。稀释法：药物梯度稀释与菌悬液混合。结果准确可测MIC，操作繁琐费时。E-test法：药物包被胶带贴平板。结果准确可测MIC，成本较高。自动化药敏：仪器同时检测多药多菌。快速准确高通量，仪器成本高。参考标准：CLSI

文件M27与M44，EUCAST

文件EDef7.3与9.3药敏结果判读要点不单一依赖MIC值药敏结果判读：结合分级、菌种与临床综合判断，不可只看MIC数值敏感（S）氟康唑·白念珠菌MIC≤2μg/mL

为敏感剂量依赖敏感（S-DD）氟康唑·白念珠菌MIC介于敏感与耐药之间耐药（R）氟康唑·白念珠菌MIC≥8μg/mL

为耐药菌种特性克柔念珠菌

对氟康唑天然耐药光滑念珠菌对唑类药物敏感性降低，需关注棘白菌素类药敏结果深部感染需选高敏感药物，并考虑组织穿透性免疫抑制患者需优先选择杀菌剂治疗监测过程中可能发生耐药，需重复药敏试验自动化药敏加样操作加样量因菌属而异吸取

100μl

真菌药敏液加入试剂板H12孔，作为

阴性对照曲霉菌属吸取上层菌悬液

100μl

加入真菌药敏液中念珠菌属和隐球菌属吸取菌悬液

20μl

加入真菌药敏液中充分混匀后继续加入试剂板其余各孔，每孔

100μl选择板卡种类，将无菌吸头、菌悬液及药敏液放入相应孔槽，试剂板放入托盘凹槽按校正键完成校正后，按

运行键

开始加样123456前沿规范展望技术迭代，规范先行质谱鉴定与2026版指南共识速览04质谱鉴定原理与流程几分钟完成菌种身份识别技术原理3步共结晶样品与基质液在靶板上形成共结晶，激光照射后电离质荷比检测离子经真空飞行管，依到达检测器时间得到质荷比与相对信号值指纹图谱比对形成核糖体蛋白指纹图谱，与数据库标准图谱比对，实现属或种水平鉴定简单快速稳定直接转移法操作流程挑取单菌落涂抹靶板，滴加基质液上机基础方法扩展转移法在直接转移法基础上增加滴加70%甲酸水溶液一步甲酸提取法先对待检样品进行甲酸提取处理，再点样上机优化方法质谱鉴定准确率优势明显鉴定准确率与效率双优以基因测序法为金标准，两种方法鉴定重症肺炎痰液样本病原菌94.86%MALDI-TOF鉴定准确率88.32%VITEK-2鉴定准确率数据库菌种274

种丝状真菌鉴定通量96

样品/小时质谱真菌鉴定方法优化破解丝状真菌鉴定率偏低痛点从45分钟到10分钟，板载提取法让丝状真菌鉴定真正实现快速准确01优化策略传统管式提取法步骤繁琐，耗时约45分钟，削弱快速优势板载提取法直接在靶板上简单处理，仅需约10分钟丝状真菌前处理技术比较：液氮研磨法、甲酸萃取法、液氮研磨联合甲酸萃取法SiriusOne系统联合MSI-2数据库与板载提取法，鉴定准确率可达94.1%10分钟板载提取法鉴定时长快速高效02标准与规范国家标准《基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱鉴别微生物方法通则》（GB/T33682-2017）已实施MALDI-TOFMS已成为微生物菌种鉴定的标准方法2017年国家标准实施时间行业标准2026版指南共识要点非培养检测成为诊断主力2026版指南更新：非培养检测成为严重真菌病诊断核心路径，脑脊液检测共识同步发布严重真菌病诊断指南更新2026非培养技术诊断强调绝大多数严重真菌病通过非培养技术诊断肺孢子菌PCR强烈推荐，扩展念珠菌PCR与毛霉目PCR适用人群曲霉GM检测高危人群扩大至重症监护和慢性呼吸道疾病患者治疗性药物监测纳入泊沙康唑与艾沙康唑脑脊液病原学检测共识2026版形成22条循证推荐意见和9条良好实践声明覆盖采集分配、转运接收、前处理、检测及质量控制全流程质量控制与技术展望规范操作是结果可靠的前提科学

严谨

规范控质量控制要求实验条件定期验证培养基

pH、孵育温度，避免假敏感或假耐药