CN119492720A 基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法 （西北农林科技大学）

基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的养2～3天；将棉花幼苗根部表皮用DAPI溶液染本发明的方法可快速高效地检测病原菌效应蛋2S1、构建携带病原菌效应蛋白编码基因和核定位信S4、将棉花幼苗根部表皮用DAPI溶液染色，制片2.根据权利要求1所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特3.根据权利要求1所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特4.根据权利要求3所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特5.根据权利要求4所述的基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其6.根据权利要求5所述的基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其7.根据权利要求6所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特8.根据权利要求1所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特9.根据权利要求1所述基于棉花根部表皮细胞检测病原菌效应蛋白定位的方法，其特34方法能够更加准确地揭示棉花黄萎病菌效应蛋白在寄主棉花根中的定位，同时具有周期[0013]更进一步的，携带病原菌效应蛋白基因和核定位信号的重组载体的基础载体为[0018]图2为实施例1的pSUL_Tef_Avr1b_NLS转化菌株中Avr1b_NLS_GFP的亚细胞定位，[0020]图4为实施例1的pSUL_Tef_VdEG1_NLS转化菌株中VdEG1_NLS_GFP的亚细胞定位，[0021]图5为对比例1的pSUL_Tef_Avr1b_NLS转化菌株中Avr1b_NLS_GFP的亚细胞定位，5[0022]图6为对比例2的pSUL_Tef_Avr1b_NLS转化菌株中Avr1b_NLS_GFP的亚细胞定位，[0023]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限[0025]本实施例的病原菌效应蛋白为黄萎病菌效应蛋白Avr1b以及VdEG1，已知Avr1b可以进入寄主细胞，但VdEG1是否能进入宿主细胞是未知的。Avr1b的NCBI序列号为XM_proteinsaredeliveredtotheseptinorganizedpenetrationinterfaceduring[0029]将Avr1b基因正向插入含有Tef强启动子的pSUL_Tef质粒的BamHI和EcoRI位点之[0031]将VdEG1基因正向插入pSUL_Tef质粒的BamHI和EcoRI位点之间，获得重组载体因2，将融合基因2基因正向插入pSUL_Tef质粒的BamHI和EcoRI位点之间，获得重组载体ATGCGTCTATCTTTTGTGCTTTCTCTTGTCGTGGCCATTGGCTACGTCGTGACCTGCAACGCAACTGAGTACTCCGACGAAACCAATATCGCCATGGTGGAATCTCCAGATCTCGTCCGTCGCTCGCTCAGGAACGGCGACATTGCCGGTGGAAGATTTCTTCGAGCTCATGAAGAGGACGATGCGGGGGAGCGGACCTTCAGCGTGACTGACCTGTGGAACAAGGTGGCGGCCAAAAAGTTGGCCAAGGCGATGCTGGCGGACCCTTCAAAGGAGCAGAAAGCGTACGAGAAGTGGGCAAAGAAGGGGTACAGCCTGGATAAGATCAAGAACTGGTTGGCAATCGCGGACCCCAAGCAGAAGGGGAAGTACGACCGTATCTACAACGGATACACCTTTCACCTGTATCAGAGCT6AAGAAACGACTGGCAAAGCTAAAAAGGAATGAAGGTCGCAGCCCTCCTCGCCCTGCCCCTCGCCGTGCTGGCCTCGCCCCTGACCTCGCCCCTGAGCGCCCGCCAGTCCTCGACCTTCTGCGACGACTGGGGCAGCGCCGTCGCGGGGCCGTACACGGTGTACAACAACCTCTGGGGCAAGGGCTCCGCGACGTCGGGCCAGCAGTGCACGACGCTCTCGGGCCTGTCGGGCAACGCCGTGTCGTGGTCGACGTCGTGGAGCTGGGCCGGCGGCCAGAACAACGTAAAGTCGTACCCCAACGCCCTGCTGGCCATTACCAAGCGGCCGCTGAGCCAGGTGTCGTCGATCCCGTCGTCGTGGTCCTGGTCCTACACGGGCTCGAGCCTCGTCGCCAACGTCGCCTACGACCTCTTCACCGGCAACACGGCCGACAGCGCGCCGGCCTACGAGATCATGATCTGGCTCGGCTCCCTCGGCGGCGCCGGCCCCATCAGCGCCACCGGCAGCACCATTGCCAACCCCACCATTGCCGGCACCACCTGGAGGCTGTACCAGGGCAGCCACAGCCAGATGAACGTCTTCAGCTTCGTCGCGCCCTCCAACATTCGCAGCTTCAACGCTGACCTGTACGCCTTTGTCAACTACCTCGCGGCCAACCACGGCCTGCCGAAGACCCAGATCCTGCAGAGCGTCGGCGCTGGCACGGAGCCGTTCACGGGGTCCAACGCCGTCTTCACGACCAGCTCGTACCAGGTTTCTGTTTCATGGCGAAGCGTGAGCGCGTGGAGATGGGCAACATGGCTCCGACCATGAAGAAGACTAAG[0038]取携带目的基因及其核定位信号的重组载体pSUL_Tef_Avr1b、pSUL_Tef_Avr1b_[0040]转入重组载体的农杆菌菌株分别与棉花黄萎病菌野生型XJ592共培养，筛选后得吸200μL混合液涂布于铺有玻璃纸的IM固体培养基上，在25℃恒温培养箱中培养36～48h；用1～2mL无菌水冲洗IM培养基上的菌体，按照800μL/平板涂布于含有100μg/mL羧苄青霉25℃恒温培养箱中培养5～7d。挑取抗性培养基上的单克隆菌落进行PCR验证及荧光观察，7菌水清洗2次；将清洗好的棉花根部表皮细胞平铺在水琼脂培养基上，在无菌操作台中晾[0047]侵染后的棉花根部表皮用浓度为10μg/mL的DAPI溶液在室温、避光条件下染色10~15min，制片后在激光共聚焦显微镜下，分别以488nm和340nm激发波长观察G于Avr1b_GFP分散在细胞质中，荧光较弱，在棉花根部表皮细胞中未观察到强烈的绿色荧根部表皮细胞的细胞核中观察到了强烈的VdEG1_NLS_GFP绿色荧光，并且与细胞核染料探究病原菌分泌的效应蛋白在侵染寄主过程中能否进入植物细胞而8