紫外吸收光谱定性定量方法

定性·定量分析紫外吸收光谱定性定量方法原理·定性·定量·应用日期2026年课程导览01原理与基础电子跃迁与朗伯-比尔定律02定性鉴别方法特征吸收峰与光谱对照03定量测定方法四大定量方法体系04应用与实践药典案例与实操要点原理与基础一切分析，始于分子对光的吸收从电子跃迁到光吸收定律，搭建分析的理论地基01紫外吸收光谱的本质紫外吸收光谱电子跃迁光谱，吸收波长

200~380nm，位于近紫外区可见吸收光谱波长

380~750nm，主要用于有色物质的定量分析分子吸收光能电子由

基态跃迁到激发态，产生特征吸收不同物质结构不同能级差不同，仅吸收特定波长的光，形成

特征吸收峰分子能级与电子跃迁分子内能等于电子能量、振动能量与转动能量之和，三种能级均量子化，跃迁所需能量不同，对应不同光学区的吸收谱带。分子内能构成总能量分子内能等于

电子能量、振动能量

与

转动能量

之和量子化三种能级均量子化光谱响应跃迁所需能量不同，对应不同光学区的吸收谱带三种能级与光谱区电子能级能级差最大，对应紫外可见光区振动能级能级差居中，对应红外光区转动能级能级差最小，对应远红外与微波区吸收光谱的双重依据定性依据吸收波长由跃迁能级差决定，反映分子内部能级分布定量依据吸收谱带强度与跃迁几率有关，正比于吸收光子数生色团与助色团的影响共轭与助色效应使吸收红移增强生色团4类具有不饱和键的原子基团，典型如：羰基偶氮基硝基氰基助色团4类含未共用电子对的基团，典型如：羟基氨基巯基卤素共轭效应两个生色团间隔一个碳原子形成共轭，吸收带红移且强度显著增加；共轭体系越长，最大吸收波长越大，是结构判断的重要线索。朗伯-比尔定律A=lg(1/T)=εbc符号含义A吸光度T透光率ε摩尔吸光系数b光程长度c溶液浓度发展历程1729年布格发现光吸收与介质厚度的关系1760年朗伯完善数学表达1852年比尔补充浓度因素物理意义平行单色光垂直通过均匀非散射吸光物质时，吸光度与浓度及吸收层厚度成正比吸光度与摩尔吸光系数对数关系吸光度与透光率互为倒数对数关系：透光率等于透射光强度除以入射光强度，吸光度等于透光率倒数的对数。典型换算A=0.5透光率31.6%A=1.0透光率10%A=2.0透光率1%摩尔吸光系数ε是物质吸光能力的量度，数值越大，方法灵敏度越高。物质ε单位L·mol⁻¹·cm⁻¹波长nm高锰酸钾2400525亚甲蓝95000665DNA6600260蛋白质10000280定律的适用与偏离适用条件平行单色光垂直照射均匀非散射体系吸光质点间无相互作用无荧光与光化学现象浓度限制仅适用于浓度小于

0.01mol/L

的稀溶液最佳读数范围读数范围吸光度

0.2~0.8，A=0.434时读数相对误差最小偏离原因物理方面入射光单色性不纯与杂散光影响化学方面溶液化学反应与高浓度效应定性鉴别方法光谱是分子的指纹峰位、峰强、峰形，三重特征锁定物质身份02定性鉴别的依据定性鉴别的依据是吸收光谱的特征，由峰位、峰强、峰形、峰数四类数据共同构成峰位最大吸收波长反映分子能级差峰强以摩尔吸光系数或百分吸收系数表示反映吸收强度峰形吸收峰的宽窄与对称性特征反映结构特征峰数吸收峰的数量与分布格局反映结构复杂性对比光谱特征数据特征波长与吸收系数是最直接的身份证据最常用于鉴别的光谱数据是吸收峰所在波长化合物有多个吸收峰时，谷与肩峰应同时列为鉴别依据吸收系数值同样常用于化合物定性鉴别01光谱特征无吸收峰200nm以上无吸收峰可能对应饱和烷烃及其衍生物02光谱特征弱吸收带270~350nm有弱吸收带且ε小于100可能对应含孤立双键的跃迁，如羰基对比吸光度比值法方法要点对具有多个吸收峰的化合物，用不同吸收峰处的吸光度比值作为鉴别依据。采用同一浓度溶液与同一厚度吸收池，比值可消去浓度与厚度的影响。适用于多吸收峰化合物，提高鉴别准确性。典型案例维生素B12波长最大吸收规定比值278nm有A361/A278=1.70~1.88361nm有—550nm有A361/A550=3.15~3.45多吸收峰化合物，提高鉴别准确性。与标准谱图对照谱图对照方法相同条件下测定样品与标准物谱图，若吸收峰特征完全相同，可能为同一化合物与手册标准谱图对照，可确定分子骨架或官能团结构信息判读Sadtler标准谱图库收录46000种化合物的紫外光谱标准谱图270~350nm弱吸收为醛酮R带，250~300nm中强吸收为芳环B带定量测定方法吸光度与浓度，一线相连标准曲线、吸收系数、对照比较，各有所长03定量分析总览定量分析的共同基础是朗伯-比尔定律，吸光度与浓度呈线性关系：A=εbc朗伯-比尔定律：吸光度与浓度呈线性关系方法选择需综合考量样品特性、分析目的与仪器条件三方面因素单组分测定常用三种方法吸收系数法依据已知吸收系数直接计算浓度标准曲线法通过系列标准溶液建立工作曲线对照品比较法在相同条件下与对照品比较吸光度复杂体系需采用针对性策略标准加入法适用于基体干扰明显的样品双波长法用于多组分同时测定导数光谱法提高重叠光谱的分辨能力吸光系数法吸光系数法（绝对法）——无需对照品，简便快捷；但需保证吸收系数准确已知无需对照品方法简便，直接计算前提条件单色光纯度足够吸收系数准确已知药典要求吸收系数通常大于

100注意仪器的校正与检定A=εbc朗伯-比尔定律浓度=A÷εb由吸光度直接计算标准曲线法建立流程01配制标准溶液配制一系列已知浓度的标准溶液，通常

四个以上02测定吸光度在

最大吸收波长

处测定各标准溶液的吸光度03绘制标准曲线以浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，也可求回归直线方程04样品测定查浓度样品在相同条件下测定，从曲线上查得浓度核心要求线性要求相关系数

不低于0.999待测液浓度应位于曲线

中部适用范围适用于

大批量样品

的测定对照品比较法供试品浓度=对照品浓度

×

供试品吸光度/对照品吸光度对照品比较法以线性关系为基石，通过三点前提保障测定的准确性。三个前提条件仪器与测定条件固定，截距为零对照品与样品浓度相近稀释倍数相同时，质量之比等于吸光度之比药典要求100%±10%对照品溶液浓度控制在供试品规定量的范围内标准加入与多组分测定双波长校正案例硝酸盐在

220nm

测定，用

275nm

校正：在220nm吸光度基础上减去

两倍

的275nm吸光度标准加入法适用于基体复杂、背景吸收显著的情况加标体积通常不超过样品体积的

10%外推至横轴交点求浓度双波长法选择两个波长，使干扰组分在其中一个无吸收通过联立方程消除干扰导数光谱法利用吸光度对波长的导数消除背景干扰、提高分辨率适用于严重重叠光谱应用与实践方法归位，方能测得准从药典案例到实操细节，完成知识闭环04药典通则概述中国药典通则0401收载紫外-可见分光光度法，用途分为两大类。“通则0401的方法体系，兼顾鉴别与检查两大应用方向。”鉴别与检查对照品比较法，以对照品同步测定比对。吸收系数法，按法定吸收系数直接计算。计算分光光度法，多波长数据处理。比色法，显色后目视或仪器测定。紫外法在药检中承担快速鉴别与批量定量药物鉴别案例品种特征吸收特征苯扎氯铵257、262、269nm

处有最大吸收维生素K1243、249、261、270nm

最大吸收，254与249nm

吸光度比值

0.70~0.75布洛芬265、273nm

最大吸收，245、271nm

最小吸收，259nm

有肩峰鉴别依据是药物在特定溶剂中的

特征吸收波长组合药物含量测定案例三种药物分别采用吸收系数法与对照品比较法测定含量对乙酰氨基酚·吸收系数法3项0.4%氢氧化钠溶液257nm

处测定百分吸收系数715含量99.05%甲氧苄啶注射液对照品比较法测定波长271nm

处测定标示量百分含量103.7%维生素B12吸收系数法测定波长361nm

处测定吸光度0.414百分吸收系数207含量98.0%杂质限量检查吸光度限度是杂质控制的有效手段峰位不重叠选择主成分无吸收、杂质有吸收的波长直接考察杂质含量峰位重叠与纯品比较吸光系数变化判断杂质是否存在及方向实操要点与注意事项样品需为均匀溶液，避免浑浊或悬浮