谷氨酸生产菌的选育

会计学1谷氨酸生产(shēngchǎn)菌的选育第一页,共15页。

谷氨酸生产菌的选育方法,主要是采用(cǎiyòng)常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。

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第1页/共15页诱变(yòubiàn)育种第三页,共15页。

利用各种诱变剂处理微生物细胞,提高基因的随即突变频率,扩大变异幅度,通过一定的筛选方法(fāngfǎ),获取所需要优良菌株的过程,称为诱变育种。

第2页/共15页诱变育种包括诱变和筛选两个部分:首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分散(fēnsàn)的微生物细胞悬浮液，在引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA结构用适宜的方法淘汰负效应变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。

01第3页/共15页02诱变(yòubiàn)育种的基本流程第五页,共15页。

合适的出发菌株→制备待处理的菌悬液→诱变处理→筛选→保藏(bǎocáng)和扩大试验第4页/共15页谷氨酸生产菌的诱变育种(yùzhǒng)流程第六页,共15页。

第5页/共15页以菌株ASL299为出发菌株,采用复合(fùhé)诱变剂进行诱变在诱变育种实践中,为了获得协同效应,常常采取诱变剂进行复合处理,可以(kěyǐ)是两种或多种诱变剂的先后使用,或是同一种诱变剂的重复使用,或是两种或多种诱变剂的同时使用。

第6页/共15页12出发菌株ASL299→菌悬液制备→硫酸二乙酯诱变→单氟乙酸平板筛选(shāixuǎn)→高糖平板筛选(shāixuǎn)→高谷氨酸平板筛选(shāixuǎn)→摇瓶筛选(shāixuǎn)→DES突变株→原生质体制备→紫外线诱变→原生质体再生→香豆素和氯化锂平板筛选(shāixuǎn)→谷氨酸为唯一碳源平板筛选(shāixuǎn)→摇瓶筛选(shāixuǎn)→UV突变株→稳定性试验→生产条件试验第7页/共15页第八页,共15页。

谷氨酸菌诱变(yòubiàn)选育操作步骤第九页,共15页。

菌悬液的制备

将出发菌株AS1.299斜面菌接入一级种子培养集中,32摄氏度振荡培养8h,离心去清夜,加入7.0缓冲液稀释菌体泥制菌悬液。

硫酸二乙酯诱变

在菌悬液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为1%（体积(tǐjī)分数)，在电磁搅拌下处理20—30分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。第8页/共15页第9页/共15页第十页,共15页。

单氟乙酸平板筛选

将诱变的菌悬液涂布在含0.5%单氟乙酸的平板上，在32摄氏度的条件下避光培养36—48h,挑取生长良好的菌落(jūnluò)。

高糖平板筛选与高谷氨酸平板筛选

将抗单氟乙酸的菌株涂在含25%葡萄糖的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌落(jūnluò)，可得到耐高糖菌株。然后，将耐高糖菌株涂在含20%谷氨酸的平板上，培养48h后，挑取生长良好的菌株，即得到耐高谷氨酸菌株。

摇瓶筛选

将突变株接入摇瓶发酵培养集中,进行摇瓶发酵,比较菌株的谷氨酸产量,选出谷氨酸高产菌株。

原生质体制备

将DES突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3)×

个/ml。然后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，最后(zuìhòu)制成原生质体的高渗悬液。取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率=第10页/共15页第11页/共15页第十二页,共15页。

原生质体的紫外线诱变

取5ml原生质体悬液放入已灭菌的9cm的培养皿中,采用15W,波长为253.7nm左右的紫外线灯进行照射,照射距离为30cm,照射时间为20-40h。照射过程采用电磁搅拌以使照射均匀。

原生质体再生

紫外线诱变后,用高渗稳定液对原生质体悬液进行适当稀释,吸取0.1ml涂布于下层(xiàcéng)固定体再生培养基上,再加入上层固体再生培养基,轻微摇匀,双层平板法于28摄氏度培养72h。取1ml原生质体悬液,用高渗稳定液稀释后涂布于下层(xiàcéng)固体再生培养基上恒温28摄氏度培养72h。更具在平板上形成的菌落数计算原生质体再生率,原生质体再生率=香豆素和氯化锂平板筛选

挑取再生(zàishēng)菌落涂在0.15%香豆素和0.5氯化锂的平板上，在32摄氏度的条件下培养48h后，挑取生长良好的菌落。

01谷氨酸唯一碳源平板筛选

用牙签法将抗维生素P类衍生物菌株接到以谷氨酸为唯一碳源平板上,在32摄氏度的条件下培养48h后,挑取省长微弱或不声张的菌株,即为不利用谷氨酸的菌落。第12页/共15页02第13页/共15页摇瓶筛选与稳定性试验

经谷氨酸为唯一(wéiyī)碳源平板筛选后,再对所选菌株进行筛选,选出