免疫学原理与技术（第2版）课件 第5、6章 抗原与抗体、抗体制备技术

第五章 抗原与抗体第一节抗原第二节抗体第三节抗原抗体反应第五章 抗原与抗体第一节抗原第二节抗体第三节抗原抗体反应第一节 抗原

一、抗原的概念二、抗原免疫原性的决定因素

三、抗原的分类四、抗原表位第一节 抗原

一、抗原的概念二、抗原免疫原性的决定因素

三、抗原的分类四、抗原表位一、抗原的概念

抗原（antigen）：是一类能刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质。免疫原性（immunogenicity）反应原性（reactogenicity）免疫原性

（immunogenicity）抗原能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞的能力

——免疫原反应原性

（reactogenicity）抗原能特异性与相应的抗体或致敏淋巴细胞反应的能力

——抗原第一节 抗原

一、抗原的概念二、抗原免疫原性的决定因素

三、抗原的分类四、抗原表位二、免疫原性的决定因素1．抗原因素2．机体因素3．抗原进入机体的方式

4.佐剂1．抗原因素

（1）非己性（2）相对分子量（3）化学组成和结构（4）分子构象和易接近性（1）非己性即外源性，抗原来自系统发育距离越远的物种，其外源性越突出，免疫原性就越强。不仅包括来自体外的物质，还应包括某些改变或隐蔽的自身抗原。抗原分子量越大，表位就越多，越能有效刺激免疫系统产生免疫应答。大分子物质在水中易形成胶体，在体内不易被破坏和清除，停留时间较长。

明胶分子量≧100kD

无免疫原性（2）相对分子量（3）化学组成和结构化学组成：蛋白质>糖类>核酸>脂类多种氨基酸线性共聚物>单一氨基酸线性共聚物含有芳香族氨基酸（如酪氨酸）的蛋白质抗原性强结构：多分支结构>直链结构球形结构>线形结构分子构象：抗原物质由于变性而发生的构象改变可导致其免疫原性发性相应改变。（3）分子构象和易接近性易接近性：是指原分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面对应的抗原受体相互接近的难易程度。2．机体因素（1）宿主的遗传背景（2）个体发育和生理状态（1）动物不同的遗传背景

个体的遗传背景不同，即不同MHC背景的动物对同一抗原产生的免疫应答有明显的差异。（2）个体发育和生理状态

青壮年比幼年和老年免疫应答强雌性比雄性动物抗体生成高感染或免疫抑制剂都能干扰和抑制动物对抗原的应答3．抗原进入机体的方式及其剂量（1）抗原进入机体的途径（2）抗原的剂量（1）抗原进入机体的途径口服(mouth)皮内注射(intracutaneousinjection,ic)皮下注射(subcutaneousinjection,sc)静脉注射(intravenousinjection,iv)腹腔注射(intraperitonealinjection,ip)肌肉注射(muscularinjection,mi)（2）抗原剂量抗原剂量：过低将导致免疫无反应过高则可产生免疫耐受(immunetolerance)

注射次数：在数周内反复注射同一抗原比一次性注射效果好。抗原量与抗体产生4．佐剂概念：是指那些与抗原一起或先于抗原注入机体后可增强机体对该抗原的免疫应答能力或改变免疫应答类型的物质。佐剂的生物学作用：增强免疫原性可提高抗体滴度改变抗体类型佐剂的作用机制：形成抗原贮存库，有利于抗原缓慢释放易局部形成炎症，促进抗原递呈刺激淋巴细胞非特异性增殖和分化种类：无机佐剂：如氢氧化铝等有机佐剂：如微生物（如分枝杆菌）和微生物代谢产物（如内毒素）合成佐剂：如双链多聚腺苷酸（PolyA）油剂：如弗氏佐剂、矿物油、植物油等弗氏不完全佐剂：乳化剂（羊毛脂）+油剂（石碏油）弗氏完全佐剂：乳化剂+油剂+死的分枝杆菌第一节 抗原

一、抗原的概念二、抗原免疫原性的决定因素

三、抗原的分类四、抗原表位三、抗原的分类

1．按化学本质分类2．按抗原性能分类3．按抗原亲缘关系分类4．按抗原的来源分类5．按抗原刺激抗体产生对T细胞依赖性分类1．按化学本质分类（1）蛋白质抗原（2）糖类抗原（3）核酸抗原2．按抗原性能分类（1）完全抗原：同时具有免疫原性和反应原性的物质（2）不完全抗原或半抗原：只有反应原性而无免疫原性的物质半抗原：多为简单的小分子物质(MW＜4Kd)，如磷脂、糖脂、核酸、低分子量多糖、药物等单独作用时无免疫原性，但与蛋白质载体（carrier）结合后可具有免疫原性能与相应抗体结合，具有反应原性半抗原的性质3．按抗原亲缘关系分类（1）异种抗原（xenogenicantigen）（2）同种异体抗原（allogenicantigen）（3）自身抗原（autoantigen）（4）异嗜性抗原（heterophileantigen)（1）异种抗原

是指与受免疫机体在种系发生上没有关系的抗原。常种属关系越远，免疫原性越强。

病原体疫苗和异种血清植物蛋白（2）同种异体抗原同种属不同个体之间，由于遗传基因不同，其相同组织或细胞表面的化学结构也有差异的抗原。

输血反应？移植排斥？不排斥？（3）自身抗原改变的自身抗原（alteredautoantigen）外伤、感染、药物或电离辐射等都可使自身组织结构发生改变，形成自身抗原。隐蔽的自身抗原（sequesteredautoantigen）与免疫系统隔绝的自身组织发生释放，刺激机体产生免疫应答。（眼球晶状体、脑、精子等）（4）异嗜性抗原

又称Forssman抗原，是指在某些不同种属动物、植物和微生物细胞表面上存在的共同抗原称为异嗜性抗原，它们之间有广泛的交叉反应性。异嗜性抗原共同的部分肝脾肾上腺制成细胞悬液抗体反应反应

Forssman抗原绵羊红细胞≈与临床免疫性疾病发生有关的异嗜性抗原乙型溶血性链球菌(A族)细胞壁与人肾小球基底膜、心瓣膜和心肌组织有共同抗原。大肠杆菌O14的脂多糖与人结肠粘膜之间也存在共同抗原，它与溃疡性结肠炎的发生有密切关系。4．按抗原的来源分类外源性抗原(exogenousantigen)内源性抗原（endogenousantigen）

外源性抗原天然抗原(naturalantigen)

如微生物、异种动植物蛋白等。②人工抗原(artificialantigen)

如碘化蛋白、偶氮蛋白等是由简单化学基团或有机分子与蛋白载体结合形成的半抗原－载体复合物。③合成抗原(syntheticantigen)

如共聚多肽、合成多肽以及用化学方法合成的高分子氨基酸聚合物和基因工程抗原等。内源性抗原①隐蔽自身抗原②变性的自身抗原③

TCR、BCR的独特型表位④肿瘤抗原⑤病毒感染细胞合成的抗原5．按抗原刺激抗体产生对T细胞依赖性分类（1）胸腺依赖性抗原（thymusdependentantigen,TD-Ag）

（2）胸腺非依赖性抗原（thymusindependentantigen，TI-Ag）TD-Ag和TI-Ag的比较特性TD-AgTI-Ag化学特性蛋白质多糖结构特点结构复杂具有多种不同决定簇，既有半抗原表位又有载体表位结构简单具有重复出现的同一种抗原表位，无载体表位巨噬细胞参与需要多数不需要

T细胞依赖性是否应答类型体液免疫和细胞免疫体液免疫诱导的Ig类型各类IgIgM免疫记忆形成不形成常见的抗原种类牛血清蛋白、卵白蛋白、类毒素肺炎球菌荚膜多糖、脂多糖、聚合鞭毛素第一节 抗原

一、抗原的概念二、抗原免疫原性的决定因素

三、抗原的分类四、抗原表位四、抗原表位

（epitope）又称抗原决定簇（antigenicdeterminant），是指存在于抗原分子表面由几个氨基酸残基组成的特殊序列及其空间结构。它决定抗原物质的抗原特异性，也是免疫反应具有高度特异性的物质基础。病毒糖蛋白的抗原表位及其特异性抗体Bin,J.,Qi,Z.,Ge,X.,Wang,R.,Yu,J.,Shan,S.,etal.(2020)PotentHumanNeutralizingAntibodiesElicitedbySARS-CoV-2Infection.BioRxivPreprint.抗原分子中的B细胞表位和T细胞表位1.线性表位；2.隐藏表位；3.构象表位线性表位（linearepitope）：由连续的氨基酸残基组成，又称连续表位（continuousepitope）构像表位（conformationalepitope）：由在空间上相邻的、连续的氨基酸残基组成，又称不连续表位（discontinuousepitope）功能性表位：指抗原分子表面的有功能的表位。隐藏表位：在抗原分子内部的表位。它不被淋巴细胞所识别，无功能，但经理化因素处理后可暴露在表面，从而作为新的功能表位发挥免疫作用，常与自身免疫病相关。第四章 抗原与抗体第一节抗原第二节抗体第三节抗原抗体反应第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征抗体

（Antibody，Ab）概念：是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的浆细胞合成分泌的一类与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。主要存在于血液、体液和粘膜分泌液中，因此将抗体介导的免疫称为体液免疫(humoralimmunity)。γ球蛋白

免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）

1968年WHO决定将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白（Ig)，而取消了“γ”这个符号，新名称反映了结构与功能的统一。Ig分泌型（secretedIg,sIg）膜结合型（membraneIg,mIg）第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征一、抗体的结构

（一）基本结构（二）功能区（三）酶解片段（一）基本结构

重链（heavychain，H链）：

420～570aa，分子量为50KD轻链（lightchain，L链）：

210～230aa，分子量为25KD免疫球蛋白分子基本结构（二）功能区（domain）

可变区（variableregion）轻链可变区：VL

重链可变区：VH可变区氨基酸的组成和排列千变万化抗原结合部位超变区（hypervariableregion，HVR）轻链：24-34、50-56、89-97重链：31-35、50-65、95-102表位互补决定区（complementarity-determiningregion,CDR）2.恒定区（constantregion，C区）CH1和CL:同种异型的遗传标志CH2:补体C1q结合位点，IgG可通过胎盘CH3/CH4:与多种细胞表面的FcR结合(免疫调理，I型超敏反应)3.铰链区（hingeregion）

CH1与CH2之间含有大量的二硫键和脯氨酸

易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解（三）Ig肽链的其他区域J链(joiningchain)是一条多肽链，富含半胱氨酸，由浆细胞合成，以二硫键的形式共价结合到Ig的重链上。分泌片(secretorypiece,SP)：由粘膜上皮细胞合成和分泌，以非共价形式结合到二聚体上，保护IgA，使之不受环境中酶的破坏，并介导IgA的转运（四）酶解片段

1959年英国牛津大学Porter用木瓜蛋白酶（Papain）水解IgG。裂解片段：两个Fab片段一个Fc片段裂解部位：为重链铰链区链间二硫键近氨基端侧断裂。1.木瓜蛋白酶酶切片段

抗原结合片段(fragmentofantigenbinding，Fab)

两个Fab段完全相同；每个Fab段由一条完整的L链和一条约为1/2的H链组成，Fab段分子量约为54KD；一个完整的Fab段可与抗原结合，表现为单价，但不能形成凝集或沉淀反应。可结晶片段

(crystallizablefragment，Fc)在低温下能够结晶。它是由连接H链的二硫键和近羧基端两条约1/2的H链所组成，分子量约50KD；该片段不能与抗原结合，具有活化补体、结合细胞和通过胎盘等生物学功能；Ig的免疫原性主要取决于Fc段

1960年美国洛克菲勒大学Edelman等用胃蛋白酶（Pepsin）裂解IgG。裂解片段：一个大片段F(ab’)2

两个Fc’片段（进一步裂解为 小分子多肽碎片pFc’）裂解部位：铰链区重链链间二硫键近C端处切断。2.胃蛋白酶酶切片段’大片段F(ab’)2是由两个Fab段和联结的铰链区组成具有双价抗体活性,能同时结合两个表位，它与抗原结合可发生凝集或沉淀反应双价的F(ab’)2与抗原结合的亲合力要大于单价的Fab。

小分子多肽碎片pFc’没有任何生物学功能抗体酶切片段第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征二、抗体的类型（一）抗体的类和型（二）抗体的血清型（一）免疫球蛋白的类和型

1.类（class）2.亚类（subclass）3.型（type）4.亚型（subtype）类

（class）

根据重链（H链）恒定区抗原特异性的差异，可分为γ、α、μ、ε和δ五大类，相应的免疫球蛋白为IgG（γ）、IgA（α）、IgM（μ）、IgE（ε）和IgD（δ）。五类抗体（γ）（α）（μ）（ε）（δ）亚类

（subclass）

在同一类免疫球蛋白中，因其重链分子结构存在的细微差别以及二硫键位置、数目的不同，又可分为亚类。IgG分为四种亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4IgA分为两种亚类：IgA1、IgA2IgM分为两种亚类：IgM1、IgM2IgD和IgE没有亚类人IgG亚类型

（type）各类免疫球蛋白又可根据轻链恒定区的抗原特异性差异，可分为κ、λ两种型。亚型

（subtype）同一型免疫球蛋白中，因其轻链分子结构（Igλ）存在的细微差别，又可分为亚型。如轻链Igλ有4个亚型。（二）抗体的血清型1.同种型（isotype）2.同种异型（allotype）3.独特型（idiotype）同种型（isotype）指同一种属内所有个体Ig共有的抗原特异性标志，其表位主要存在于恒定区。种属特异性标志同种异型（allotype）指同一种属不同个体间的抗体具有的抗原性差异，其表位广泛存在于抗体的恒定区和可变区。个体特异性标志指每个抗体在其可变区所特有的抗原特异性标志。通常是由可变区中尤其是超变区的氨基酸组成、排列和构型所决定的。独特型（idiotype）第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征1.抗体的重链基因和轻链基因三、抗体的编码基因及重排2.重链基因重排和表达3.轻链基因重排和表达抗体的类别转换第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征抗体的中和、调理作用对补体的激活作用NK细胞介导的ADCC作用第二节 抗体

一、抗体的结构二、抗体的类型三、抗体的编码基因及重排四、抗体的生物学活性五、各类抗体的生物学特征五、各类抗体的生物学特征IgGIgMIgAIgDIgEIgG多为单体血清含量最高(75%～85%),也是丙种球蛋白的主要成分半衰期最长（～23d）主要的抗感染抗体(具有抗菌、抗病毒、中和毒素和免疫调理作用)---主力免疫作用是唯一能通过胎盘的抗体1.IgG为五聚体，是分子量最大的Ig，称巨球蛋白。IgM激活补体、结合抗原、免疫调理作用比IgG强最早出现的免疫球蛋白，但半衰期短---先锋免疫作用（可用于早期诊断）天然血型抗体是IgM2.IgM分为血清型和分泌型两种。血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生，为单体。而分泌型IgA（sIgA）是由呼吸道、消化道、泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生，为双体。sIgA主要存在于唾液、泪液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中。3.IgA以单体形式存在，不能激活补体表达在B细胞表面的IgD作为BCR的重要组成成分B细胞的分化过程中首先出现mIgM，mIgD的出现标志着B细胞成熟对防止免疫耐受有一定作用4.IgD血清中含量最低（0.002%）可与肥大细胞、嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fcε受体（FcεR）结合，引起Ⅰ型超敏反应主要由呼吸道和胃肠道粘膜固有层中的浆细胞产生5.IgE第四章 抗原与抗体第一节抗原第二节抗体第三节抗原抗体反应第三节 抗原抗体反应一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特性三、抗原抗体反应的影响因素

抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction)是指抗原与相应抗体在人和动物体外或体内所发生的特异性结合反应。在体外发生的抗原抗体反应又称为血清学反应（serologicreaction），包括凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、中和反应。第三节 抗原抗体反应一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特性三、抗原抗体反应的影响因素

一、抗原抗体反应的原理1．抗原与抗体反应中的作用力2．抗原抗体反应的价3.抗体亲和力和亲合力1.抗原与抗体反应中的作用力（1）氢键（2）静电力（3）疏水键（4）范德华引力

1.氢键

（hydrogenbond） 氢键是一个与带负电荷原子共价结合的氢原子（H＋），再与另一个带负电荷原子形成的非共价键。－O…H－O－－O…H－N－－N…H－N－

2.静电力

（electrostaticforce） 抗原与抗体之间的静电力是由抗原分子上一个或多个离子基团与抗体的抗原结合位点上带相反电荷的离子基团间相互吸引而产生的。又称库伦引力（Columbicattractionforce）F2=1/d2静电力3.疏水键

（hydrophobicbond）抗原与抗体分子侧链上的某些氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）是疏水基团，在水中不形成氢键，更倾向于彼此间相互吸引，故又称为疏水性作用(hydrophobicinteractions)。4.范德华引力

（VanderWaal’sattractionforce） 又称分子间力，是指所有相距很近的原子、分子表面之间存在的相互吸引力。2.抗原抗体反应的价（1）抗原的价（2）抗体效价（3）抗体的价抗原结合价≤表位数抗原结合价（antigenicvalence）：是指一个抗原分子上能与相应抗体分子结合的表位的总和。（1）抗原的价不同大小抗原的结合价是衡量血清中抗体水平的一项常规的检测指标，代表了血清中所含抗原的浓度与活性。（2）抗体效价以呈现阳性反应时抗体的最高稀释倍数为效价。（3）抗体的价IgGIgDIgE血清型IgA分泌型IgA：四价IgM类抗体：十价两价3.抗体亲和力和亲合力抗体亲和力（affinity）：是指抗体分子单一抗原结合位点与一个单一抗原表位之间的结合力。用亲合常数（affinityconstant,Ka）表示。抗体亲合力（avidity）：是指抗体分子所有抗原结合部位与一个抗原分子上多个相同有位互补结合强度的总合。亲和力和亲合力的差异第三节 抗原抗体反应一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特性三、抗原抗体反应的影响因素

二、抗原抗体反应的特性

1．抗原抗体反应的特异性2．抗原抗体反应的交叉反应性3．抗原抗体反应的比例性4．抗原抗体反应的阶段性5．抗原抗体反应的可逆性1．抗原抗体反应的特异性特异性（specificity）免疫原性的特异性反应原性的特异性抗体CDR所组成的抗原结合槽和抗原2.抗原抗体反应的交叉性共同抗原类属抗原：同一种属异嗜性抗原：不同种属3．抗原抗体反应的比例性

抗原抗体反应时，两者只有在适当的比例时，才能出现可见的反应。此时抗原与抗体的浓度比称为最适比例（optimalratio），亦称为等当点（equivalentpoint）。等价带前带抗体过剩带后带抗原过剩带4.抗原抗体反应的阶段性特异性结合阶段可见反应阶段反应发生迅速，数秒至几分钟，无肉眼可见现象此阶段较长，历时数分钟、数小时或数天复合物凝聚和形成交叉网状，出现肉眼可见的反应（凝集、沉淀或细胞溶解）抗原与抗体为非共价键结合，一定条件下可以解离（如低pH值、冻融、高浓度盐）可用于分离细菌、亲和层析等5．抗原抗体反应的可逆性第三节 抗原抗体反应一、抗原抗体反应的原理二、抗原抗体反应的特性三、抗原抗体反应的影响因素

三、抗原抗体反应的影响因素

1．电解质2．pH3．温度1.电解质适当浓度的电解质可中和抗原和抗体的表面电荷，促进二者结合

0.85%NaCl生理盐水作为抗原和抗体的稀释剂和反应溶液高浓度盐（如硫酸铵）具有脱水作用，有利于抗原抗体复合形成2．pH

有利于抗原抗体结合的条件：中性pH

有利于抗原抗体解离的条件： 高pH（9.0～10）比低pH（2～4）更有利于解离，且变性少3.温度有利于抗原抗体结合的条件：低温有利于抗原抗体解离的条件：高温第六章

抗体制备技术第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法一、

多克隆抗体制备的原理

多克隆抗体制备的基本流程抗原制备动物免疫抗体纯化第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法二、

多克隆抗体制备的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备二、

多克隆抗体制备的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备

细胞、细菌和病毒等，一般具有较强的免疫原性，可不加佐剂。例如，直接腹腔注射1-2×107个细胞。颗粒性抗原：可溶性抗原的来源主要是天然纯化，或者用目的基因在原核或真核细胞内表达。可溶性抗原需与弗氏完全或不完全佐剂混匀，进行免疫。可溶性抗原：1.免疫原的制备

1.免疫原的制备

（1）完全抗原的提取（2）半抗原与载体的交联（3）合成肽抗原（1）完全抗原的提取细胞破碎法抗原的提取抗原的纯化冷热交替法反复冻融法超声破碎法玻璃匀浆法自溶法酶处理法水溶液提取法有机溶剂提取法超滤盐析电泳凝胶过滤离子交换亲和层析･･････载体的选择半抗原与载体的偶联方法偶联复合物的鉴定天然蛋白质合成类载体吸收光谱法放射性标记法（2）半抗原与载体的交联化学偶联法半抗原的制备抗原合成多肽、甾体激素、核酸、化学药物等载体选择天然载体：人、牛血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白、钥孔磩血蓝素等合成载体：多聚赖氨酸、二软脂酰赖氨酸、多聚谷氨酸等载体偶联羧基、脂族氨基、芳香族胺、连位羧基、甾族、苯酚类载体的氨基、羧基、酪氨酸抗原鉴定吸收光谱、同位素标记半抗原与载体偶联策略免疫原性肽的选择肽的合成与纯化计算机模拟试验凝胶过滤法反向高效液相色谱（3）合成肽抗原二、

多克隆抗体制备的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备2.免疫动物的选择

兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多（新西兰、大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少（BALB/C、昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品）马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品）。豚鼠（guineapig）：国外实验室常用二、

多克隆抗体制备的基本条件

1.免疫原的制备2.免疫动物的选择3.佐剂的准备佐剂的种类

无机佐剂：

氢氧化铝、明矾等

有机佐剂：

分枝杆菌、百日咳杆菌、内毒素等

合成佐剂：

双链多聚核苷酸、左旋咪唑、异丙肌苷

油剂：

弗氏佐剂、花生油、矿物油、植物油等佐剂的生物学功能（1）缓释（2）促吞噬（3）激活免疫应答（4）增强辅助性T细胞（5）促进淋巴细胞分化和抗体分泌（6）提高初次和再次免疫应答的抗体滴度（7）改变抗体类型、促进迟发性超敏反应福氏佐剂（1）福氏不完全佐剂：油剂（石蜡油或花生油）与乳化剂（羊毛脂或Tween80或胆固醇）混合（2）福氏完全佐剂：福氏不完全佐剂+卡介苗（2-20mg/ml）抗原与福氏佐剂的混合（1）研磨法：适用于制备大量的佐剂抗原（2）注射器法：适用于制备少量的抗原乳剂（3）超声波：控制超声频率和时间铝佐剂的制备磷酸氢二钠（Na2HPO4） 240mg磷酸二氢钾（KH2PO4） 174mg醋酸钠（CH3COONa·3H2O） 100mg氯化钠（NaCL） 11mg硫酸铝钾 10g蒸馏水 100ml铝佐剂∶蛋白质(10mg/ml) = 25.6∶1抗原与铝佐剂的混合（1）逐步将铝佐剂加入抗原溶液（2）调节pH至5.5，促进蛋白质沉淀（3）离心后沉淀用pH5.5的溶液悬浮至10mg/ml。第一节

多克隆抗体制备技术

一、多克隆抗体制备的原理二、多克隆抗体制备的基本条件三、多克隆抗体制备的基本方法三、多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存三、多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存抗原的剂量蛋白质抗原耐受剂量小鼠：为20～400μg/0.2ml/次大鼠：100～1000μg/0.5ml/次兔：200～2000μg/2ml/次

羊：5～20mg/5ml/次免疫动物的方法

免疫原制备无佐剂免疫法——适用于颗粒性抗原福氏佐剂免疫法——适用于可溶性抗原铝佐剂免疫法——适用于人免疫免疫动物皮内免疫法皮下或肌肉免疫法淋巴结免疫法混合法

抗体效价满意后静脉注射加强免疫抗原免疫的基本策略加强免疫的剂量：约首次剂量的1/2加强免疫的时间：间隔2～8周加强免疫次数：2-5次高特异性的抗血清：低剂量短间隔免疫法高效价的抗血清：高剂量长程免疫法实验动物的操作豚鼠及大鼠的抓取家兔的抓取常见注射方法肌肉注射法尾静脉注射三、多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存抗血清的获得

眼眶取血颈动脉放血心脏采血免疫效果评价取血：兔耳静脉、鼠尾静脉检测：双向免疫扩散（1:32以上）ELISA（1：5000以上）三、

多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存3.抗体的分离和纯化技术

盐析法

凝胶过滤法

离子交换层析法

亲和层析法

电泳分离法4、亲和层析法原理：利用蛋白质之间的特异性结合（抗体-抗原，受体-配体）将一种配基与凝胶颗粒结合,捕捉与它相配的物质。洗脱一般采用改变pH值的方法使用前样品结合(Binding)洗脱(Elution)主要步骤：将ProteinA与活化的柱子相结合(买商品柱)；将腹水或血清处理后过柱；用结合缓冲液洗柱子，直到A280值为零；用甘氨酸缓冲液洗脱抗体，等量收集洗脱液；测定洗脱液的A280值，保留A280值明显升高的样品；汇集样品，浓缩，测定浓度。特点：成本高，步骤较简单抗体回收率低抗体纯度高，适合于各种标记纯化后抗体体积大，需要浓缩需要自动收集器葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA，SPA)：金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白分子量42000,等电点pH5.1可与大多数动物Ig的Fc段结合一个SPA分子有4个相似的活性部位与IgG的结合最强,与IgM,IgA的结合较差

三、

多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存4.抗体的鉴定蛋白浓度测定：

紫外分光比色法，双缩脲法，

福林-酚法，

二辛可宁酸（BCA）法，

考马氏蓝法，Lowry法等免疫效果评价：

双向免疫扩散，ELISA纯度分析：免疫印迹抗体类别分析：免疫金试条亲和力分析：ELISA、Biacore、荧光偏振三、

多克隆抗体制备的基本方法

1.抗原剂量、免疫途径与免疫日程2.小样试血与采血3.抗体的分离和纯化技术4.抗体的鉴定5.抗体的保存5.抗体的保存抗体的浓缩：

吸收、蒸发、超滤抗体的保存：

浓缩抗体+防腐剂+甘油免疫效果不佳可能的原因抗原纯度不够免疫原性低免疫途径乳化不完全免疫剂量不合适动物动物疾病种属差异小肿瘤免疫治疗抗体制备特异性高质量稳定成本低廉工艺简单异源性低穿透性好功能丰富多克隆抗体难以满足实际需求第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法单克隆抗体制备技术细胞工程抗体技术、B细胞杂交瘤技术问题的由来：

B细胞抗体单克隆B细胞单克隆抗体如何获得抗原特异性的B细胞克隆？如何使B细胞长期存活，永远产生抗体？

而：

肿瘤细胞永生性细胞功能的嵌合BCELLCANCERCELL？抗体分泌永生性可能性：Barski等（1960）发现细胞的自然融合现象，但频率很低。冈田等（1967）和Kao等（1974）分别发现灭活的仙台病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）能显著提高细胞融合率。Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495绵羊红细胞小鼠脾细胞导致生命科学领域的一场革命！骨髓瘤细胞仙台病毒GeorgesJ.F.KöhlerCésarMilsteinHybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075NielsK.JerneGeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerland(1946-1995)CarMilstein(1927-2002)ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdom第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法单克隆抗体的制备过程

二、单克隆抗体制备的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选和培养3.单抗检测方法的建立二、单克隆抗体制备的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选和培养3.单抗检测方法的建立1.动物的免疫抗原与载体动物的选择免疫途径第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐剂第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐剂第三次免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后检测血清效价加强免疫：可溶性抗原加生理盐水小鼠腹腔注射细胞融合3天后免疫动物二、单克隆抗体制备的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选和培养3.单抗检测方法的建立融合后的细胞类型脾细胞脾细胞×脾细胞脾细胞×瘤细胞瘤细胞×瘤细胞瘤细胞BCELLCANCERCELL骨髓瘤细胞的演化酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选HGPRT缺陷型骨髓瘤细胞的选择：

8-杂氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG）

6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG)TK缺陷型骨髓瘤细胞的选择：溴脱氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，

BrdU）细胞DNA生物合成途径嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）酶缺陷型细胞的筛选嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU二、单克隆抗体制备的基本条件

1.动物的免疫酶缺陷型骨髓瘤细胞的筛选和培养3.单抗检测方法的建立单克隆抗体的鉴定免疫酶技术免疫荧光技术免疫扩散试验第二节单克隆抗体制备技术

一、单克隆抗体制备的原理二、单克隆抗体制备的基本条件三、单克隆抗体制备的基本方法三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产组织培养的基本条件仪器：包括CO2培养箱、倒置显微镜、超净工作台、液氮罐、低速低温离心机等试剂：培养液、HAT培养液、HT培养液、

牛血清、抗生素等耗材：培养板、培养瓶、吸管、移液管等组织培养的常用仪器骨髓瘤细胞系的选择要点所选择的骨髓瘤细胞应与提供免疫脾细胞的动物品系相同自身不产生免疫球蛋白的重链与轻链对氨基碟呤敏感与免疫脾细胞融合后产生稳定分泌Ig杂交瘤细胞三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产饲养细胞的作用：小鼠腹腔巨噬细胞小鼠脾细胞成纤维细胞饲养细胞（feedercell）

增加细胞密度，满足新生的杂交瘤细胞对细胞密度的要求吞噬清除死亡的细胞分泌生长刺激因子促进杂交瘤细胞的生长饲养细胞的种类和制备方法：三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产拉颈处死小鼠无菌操作取出脾脏清洗、研磨收集细胞离心洗涤细胞计数脾细胞的分离三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产细胞融合的方法

PEG融合仙台病毒电融合细胞融合骨髓瘤细胞与脾细胞

按1:10或1:5的比例混合并加入促融剂PEGPEGPEG介导的细胞融合融合后的细胞类型脾细胞脾细胞×脾细胞脾细胞×瘤细胞瘤细胞×瘤细胞瘤细胞BCELLCANCERCELL三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产杂交瘤细胞的选择性培养HAT选择性培养的原理：细胞的DNA生物合成有主要途径和补偿途径。当有氨基碟呤存在时，能够阻断DNA合成的主要途径，需通过补偿途径合成DNA，这时就需要次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）利用次黄嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。正常细胞DNA生物合成途径嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）氨基蝶呤（A）酶缺陷型细胞的筛选嘌呤合成旁路途径核酸生物合成主要途径嘧啶合成旁路途径次黄嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷单磷酸DNA胸腺嘧啶脱氧核苷酸鸟嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU氨基蝶呤（A）HAT选择性培养H：次黄嘌呤A：氨基喋呤T：胸腺嘧啶核苷

融合后3~4天后，可见外形似骨髓瘤细胞，浑圆透亮的克隆。融合后第7~9天取培养上清，检测特异性抗体。细胞生长情况：

筛选后存活的细胞脾细胞脾细胞×脾细胞脾细胞×瘤细胞瘤细胞×瘤细胞瘤细胞获得杂交瘤细胞三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产分泌单克隆抗体杂交瘤细胞的检测方法免疫酶技术间接ELISA免疫荧光技术间接免疫荧光测定法

流式细胞术分析（阴性对照：骨髓瘤细胞培养上清；

阳性对照：免疫鼠血清）三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产阳性细胞的单克隆化克隆（cloning）：由单个细胞繁殖、扩增而形成性状均一的细胞集落的过程。有限稀释法软琼脂克隆技术有限稀释法

从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞。软琼脂克隆技术

从阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，以适当浓度杂交瘤细胞加入软琼脂培养基中，形成由一个细胞增殖而成的细胞集落。。杂交瘤细胞的克隆化筛选单克隆抗体的鉴定抗体敏感性的测定——对腹水和培养上清进行效价测定抗体特异性的检测——是否与其他抗原有交叉反应抗体效价的测定抗体亚类的鉴定——IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3），IgM抗体亲和力分析识别表位分析三、单克隆抗体制备的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤细胞的培养饲养细胞的制备脾细胞的分离细胞融合HAT选择性培养阳性克隆的筛选克隆化培养单克隆抗体的扩大生产单克隆抗体的扩大生产细胞培养法（50μg/ml）小鼠体内诱生法（mg/ml）生物反应器（g/10L）细胞培养法杂交瘤细胞培养瓶或罐中培养收集上清液纯化抗体动物体内诱生法Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷腹腔内接种杂交瘤细胞收集腹水生物反应器单抗制备常见问题污染：培养环境、操作融合细胞不生长：PEG、血清、HAT培养基抗体分泌不足：支原体污染、细胞突变、

培养体系有问题杂交瘤细胞难以克隆化：血清质量、细胞活性抗体制备特异性高质量稳定成本低廉工艺简单异源性低穿透性好功能丰富第一节 多克隆抗体制备技术第二节 单克隆抗体制备技术第三节 基因工程抗体制备技术第四节 抗体库技术

第六章 抗体制备技术

基因工程抗体基因工程抗体优点抗体制备特异性高质量稳定成本低廉工艺简单异源性低穿透性好功能丰富原核表达抗体人源化小分子抗体双功能抗体易于改造亲和力成熟产业化第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗体融合蛋白第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗体融合蛋白鼠源抗体应用中的障碍免疫原性半衰期短抗体功能片段失活（Fc）一、鼠源抗体人源化1.嵌合抗体2.改型抗体1.嵌合抗体

（chimericantibody）可变区基因的克隆表达载体的构建嵌合抗体的表达2.人改型抗体基因工程抗体种类第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗体融合蛋白二、小分子抗体1.Fab段抗体Fv抗体和单链抗体单域抗体最小识别单位小分子抗体的优点可在原核体系中表达，降低生产成本因其分子量小，穿透能力强，易进入病灶部位，有利于对肿瘤等疾病的治疗不含Fc段，不与Fc受体结合，可减少因广泛分布的Fc受体而带来的不利影响在体内半衰期较短，有利于体内毒性物质的清除易于进一步基因工程改造第三节基因工程抗体制备技术

一、鼠源抗体人源化二、小分子抗体三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白1.重组免疫毒素其他抗体融合蛋白胞内抗体双价抗体抗体酶抗原化抗体嵌合受体93percentofadvancedleukemiapatientsinremissionafterimmunotherapy2016年4月26日，美国著名癌症研究中心FredHutchinsonCancerResearchCenter传出捷报：至今规模最大的以CD19为靶点的CAR-T临床试验，在治疗急性淋巴细胞白血病（ALL）临