牛奶中酪蛋白的分离与鉴

实验(shíyàn)内容1牛奶中水分含量的测定(cèdìng)2牛奶中粗脂肪的提取与测定(cèdìng)3牛奶中酪蛋白的提取(tíqǔ)4蛋白质含量的测定第1页/共32页第一页,共32页。

（1)牛奶(niúnǎi)中水分含量的测定

水分是食品分析的重要项目之一。水分测定对于计算生产中的物料平衡，和实行工艺监督等方面，有很重要的意义。各种食品水分的含量差别很大。例如，鲜果为69.7%-92.5%，鲜菜为79.7%-97.1%，鲜瘦肉52.6-77.4%，面粉12-14%。面包水分随品种不同略有差异，一般为32-42%水分测定法通常可分为直接法和间接法两类。

利用水分本身的物理性质和化学性质测定水分的方法，叫做直接法，如重量(zhòngliàng)法，蒸馏法和卡尔.费休法等；

利用食品的比重，折射率，电导，介电常数等物理性质测定水分的方法，叫做间接法。测定水分的方法要根据食品的性质和测定目的来选定第2页/共32页第二页,共32页。

一重量(zhòngliàng)法第三页,共32页。

凡操作过程中包括有称量步骤的测定方法，统称为重量法，如烘箱干燥法，红外线干燥法，干燥剂法等。

烘箱干燥法

在一定温度和压力条件下，将样品加热干燥，以排除(páichú)其中水分的方法，叫做烘箱干燥法。它包括常压烘箱法和真空烘箱干燥法。这种测定方法费时长，但操作简便，应用范围较广。

应用本法测定水分的样品应符合下述条件：(1)水分是唯一的挥发物质;(2)水分的排除(páichú)情况很完全;(3)食品中其他组分在加热过程中由于发生化学反应而引起的重量变化可以忽略。

第3页/共32页二材料(cáiliào)与仪器第四页,共32页。

材料(cáiliào)全脂牛奶层析滤纸器材常压电热烘箱干燥器电子分析天平第4页/共32页第5页/共32页三操作步骤第五页,共32页。

取一张12cm*12cm70℃过夜烘干的层析滤纸,称重,记为m1。准确称取一定量牛奶m2,滴于滤纸上,70℃烘干后称重,记为m3。计算水分(shuǐfèn)含量。

干物质质量m4=m3-m1水分(shuǐfèn)含量（%)=（m2-m4)/m2×100粗脂肪的定量测定(cèdìng)─索氏提取法01、目的要求学习和掌握粗脂肪的定量测定(cèdìng)法─索氏提取法第6页/共32页02二、原理脂肪是丙三醇(甘油)和脂肪酸结合成的脂类化合物,能溶于脂溶性有机溶剂。本实验用重量法，利用脂肪能溶于脂溶性溶剂这一特性，用脂溶性溶剂将脂肪提取出来，借蒸发除去溶剂后称量。整个提取过程均在索氏提取器中进行(jìnxíng)。通常使用的脂溶性溶剂为乙醚或沸点为30ºC-60ºC的石油醚。用此法提取的脂溶性物质除脂肪外，还含有游离脂肪酸、磷酸、固醇、芳香油及某些色素等，故称为"粗脂肪”。

第7页/共32页第七页,共32页。

三、适用范围与特点(tèdiǎn)第8页/共32页第八页,共32页。

适用于脂类含量较高，结合态脂类含量少或经水解处理过的，（结合态已转变成游离态)，样品应能烘干，磨细，不易吸湿(xīshī)结块。

01此法经典，对大多数样品的测定结果比较可靠。但费时长（8—16h)溶剂用量大，需要专门的仪器,索氏提取器。

02材料、试剂与器材第9页/共32页第九页,共32页。

材料:全脂牛奶(niúnǎi)01试剂:乙醚02器材:索氏提取器、干燥箱、电子分析天平03索氏提取(tíqǔ)器构造操作方法1抽提筒的准备抽提将测定完水分带有干物质的滤纸折成小包放入抽提筒，再放入索氏抽提器内，连接已干燥至恒重（m5)的脂肪接受瓶，由冷凝管上端加入无水乙醚，加量为接受瓶的2／3体积，于60℃水浴上加热，使乙醚不断的回流提取(tíqǔ)，一般视含油量高低提取(tíqǔ)6—12小时，至抽提完全为止（用滤纸试)。第11页/共32页3称重(chēnɡzhònɡ)第十二页,共32页。

第12页/共32页取下接受瓶，回收乙醚，待接受瓶内乙醚剩1～2ml时，在水浴上蒸干，再于100～105℃干燥2小时，取出放干燥器内冷却30分钟，称重(chēnɡzhònɡ)，并重复操作至恒重（m6)。取出滤纸包，于户外晾至无乙醚味，置入恒温箱内，烘干，然后移入干燥缸内冷却后称重(chēnɡzhònɡ)，重复操作至恒重（m7)。

六结果(jiēguǒ)处理方法一

脂肪(％)＝(m6-m5)/m4×100m6——接受(jiēshòu)瓶和脂肪的质量，g;m5——接受(jiēshòu)瓶的质量，g;m4——样品的质量(如为测定水分

后的

样品质量计)，g。

方法二脂肪(％)＝(m3-m7)/m4×100m3——未抽提滤纸包的质量，g;m7——抽提后滤纸包的质量，g;m4——样品(yàngpǐn)的质量(如为测定水分

后的

样品(yàngpǐn)质量计)，g。

第13页/共32页第十三页,共32页。

注意事项第14页/共32页第十四页,共32页。

乙醚为易燃有机溶剂,实验室应保持通风并禁止任何明火。

抽提用的乙醚或石油醚要求无水、无醇、无过氧化物,挥发残渣含量低。因水和醇可导致水溶性物质溶解,如水溶性盐类、糖类等,使得测定结果偏高,被测样品也要事先烘干。过氧化物会导致脂肪氧化,在烘干时也有引起爆炸的危险(wēixiǎn)。

装样品的滤纸筒一定要严密,不能往外漏样品,也但不要包得太紧影响溶剂渗透。放入滤纸筒时高度不要超过回流弯管,否则超过弯管的样品中的脂肪不能提尽,造成误差。

思考题第十五页,共32页。

实验制备得到的是粗脂肪,若要制备单一组分的脂类成分,可用什么方法进一步处理?实验样品制备时烘干为什么要避免(bìmiǎn)过热第15页/共32页第16页/共32页02酪蛋白的提取、目的要求(yāoqiú)掌握一种提取酪蛋白的方法掌握一种检测牛乳质量的方法01二实验(shíyàn)原理第十七页,共32页。

酪蛋白是乳蛋白质中最丰富的一类蛋白质，占乳蛋白的80%~82%，酪蛋白不是单一的蛋白质，是一类含磷的复合蛋白质混合物，以一磷酸酯键与苏氨酸及丝氨酸的羟基相结合。它还含有(hányǒu)胱氨酸和蛋氨酸这两种含硫氨基酸，但不含半胱氨酸。它在牛乳中的含量约为35g/L，比较稳定，利用这一性质可以检测牛乳中是否掺假。酪蛋白在其等电点时由于静电和为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度很低，利用这一性质，将牛乳调到pH4.6，酪蛋白就可从牛乳中分离出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂志除去。

第17页/共32页三仪器、原料(yuánliào)和试剂第18页/共32页第十八页,共32页。

仪器:温度计、布氏漏斗、pH试纸、抽滤瓶、水浴锅、烧杯、

量筒、表面皿、天平、离心机等原料(yuánliào):市售全脂牛奶试剂:无水乙醇、无水乙醚pH4.7乙酸钠缓冲液0.2mol/L乙醇、乙醚混合液：乙醇:乙醚=1:1（体积比)四实验(shíyàn)步骤1、酪蛋白等电点沉淀

将100mL牛乳(niúrǔ)放到500mL烧杯中，加热到40℃，加入到同样40℃的乙酸钠缓冲液中，调pH达4.7。此时有絮状的蛋白质沉淀析出。将悬浮液冷却至室温，室温放置分层

，3000r/min离心15min，收集沉淀。2、水洗

将pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液用蒸馏水稀释10倍，洗涤粗制品三次，分别离心10分钟，得到沉淀蛋白。

3.去脂

将粗制品中加入10ml无水乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中，用乙醚-乙醇混合液洗涤沉淀两次，最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开以除去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。准确称重后，计算出每100mL牛乳(niúrǔ)所制备出的酪蛋白质量（g/100mL），并与理论产量（3.5g/100mL）相比较，求出实际获得百分率。

第19页/共32页第十九页,共32页。

五思考题第二十页,共32页。

用乙醇、乙醇-乙醚和乙醚洗涤蛋白质的顺序是否可以变换?为什么?试设计一个利用(lìyòng)蛋白质其他性质提取蛋白质的实验第20页/共32页12第21页/共32页六离心机的使用(shǐyòng)及注意事项第二十一页,共32页。

离心机的工作原理：在离心力场的作用下，可加速悬浮液中固体颗粒沉降或漂浮的速度，从而将不同的物质分离。它是生化实验中提取、分离、纯化的常用设备，操作的关键环节是平衡。注意事项

1.检查内、外套管应完整不漏，洗净离心管；2.待离心的物质装入离心管的量不应超过离心内套管体积的2/3；3.将一对离心管（含内、外套管)放在台秤上平衡；4.检查离心机正常后，将平衡好的离心管对称的放在离心机中；5.盖好离心机盖，打开电源开关，设置转速与时间，开始离心。注意一定不能超过离心机的最大离心速度！离心结束后，待离心机停止运转后，再打开机盖，取出离心管，不许用手强行使离心机停止转6．用完后，将内外套管洗净，倒立放置，使其干燥，并在使用(shǐyòng)的登记薄签名。7.使用(shǐyòng)过程中，如出现故障，一定请本室的实验员排除，不许擅自处理（4)蛋白质浓度(nóngdù)的测定—考马斯亮蓝染色法第22页/共32页第二十二页,共32页。

实验目的学会(xuéhuì)用考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度二实验(shíyàn)原理第二十三页,共32页。

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合(jiéhé)，这种结合(jiéhé)具有高敏感性。考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当与蛋白质结合(jiéhé)形成复合物时呈蓝色，最大吸收峰改变为595nm,考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度（比Lowry法灵敏4倍)在一定范围内，蛋白质和染料考马斯亮蓝结合(jiéhé)符合比尔定律

，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合(jiéhé)的蛋白质量。

第23页/共32页0102CoomassieDye-Based蛋白质定量(dìngliàng)PROTEIN+Amax=595nmBLUEAcidCoomassieG-250Protein-DyeComplexOCH2CH3NHCCH3CH3NCH2SO3-CH3CH2NCH2CH2CH3SO3Na+第24页/共32页第二十四页,共32页。

三实验(shíyàn)试剂与器材第25页/共32页第二十五页,共32页。

试剂19%NaCl溶液2标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml)3染液：考马斯亮蓝G250（0.01%)4样品液:酪蛋白溶液5器材6漩涡混合器试管(shìguǎn)吸管容量瓶量筒电子分析天平比色皿7722型分光光度计8操作方法第二十六页,共32页。

四、

操作方法1.标准曲线制作取14支试管，分两组按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白溶液(mL)00.10.20.30.40.50.60.9%NaCl溶液（mL)1.00.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂(mL)4444444蛋白质浓度(

g/mL)0102030405060A595nm摇匀，1h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量(hánliàng)为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。

第26页/共32页酪蛋白浓度(nóngdù)的测定称取一定量的酪蛋白，用0.9%NaCl溶液溶解定容至一定体积（使其测定值在标准曲线的直线范围内)。测定方法同上，根据所测定的OD595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(nóngdù)(

g/mL)。

五注意事项第二十八页,共32页。

1如果测定要求(yāoqiú)很严格,可以在试剂加入后的5-20min内测定光吸收,因为再这段时间内颜色最稳定。

2测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。

3一些阳离子如K+、Na+、Mg2+、乙醇等物质对测定无影响,而大量的去污剂如SDS等会严重干扰测定。第28页/共32页722型分光(fēnɡuānɡ)光度计使用方法第29页/共32页将灵敏度旋钮调至“1”档（放大倍率最小)。调波长调节器至所需波长。开启电源开关，指示灯亮，选择开关置于“T”，调节透光率[100%T]旋钮使数字显示[100.0]左右，预热20min.调整01打开吸收池暗室盖（光门自动关闭)，调节[0%T]旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上吸收池盖，将参比溶液置于光路，使光电管受光，调节透光率[100%T]旋钮，使数学显示为“100.0”。如果显示不到“100”，则可适当增加电流(diànliú)放大器灵敏度档数，但应尽可能使用低档数，这样仪器将有更高的稳定性。当改变灵敏度

后必须重新校正“0”和“100”。按（