医院消毒灭菌效果监测技术

医院消毒灭菌效果监测与检验技术

湖南省CDC李世康医院消毒灭菌效果监测技术第1页目录2.消毒灭菌监测检验标准与条件要求3.监测采样、检测及评价方法

1.监测与检验相关标准介绍医院消毒灭菌效果监测技术第2页目录2.消毒灭菌监测检验标准与条件要求3.监测采样、检测及评价方法

1.监测与检验相关标准介绍医院消毒灭菌效果监测技术第3页1.医院消毒灭菌监测与检验相关标准介绍洁净手术部空气医院洁净手术部建筑技术规范GB50333-皮肤黏膜消毒液皮肤消毒剂卫生要求GB27951-;黏膜消毒剂通用要求GB27954-透析用水血液透析和相关治疗用水YY0572-2005（）；《中国药典》1143细菌内毒素检验法灭菌医疗器具敷料等《中华人民共和国药典》2015年版1101“无菌检验法”压力蒸汽灭菌器消毒与灭菌效果评价方法与标准GB15981-1995医院污水医疗机构污水排放要求GB18466-医院消毒卫生标准GB15982-致病菌检测中大肠、沙门、乙型溶链、绿脓、金葡分别按GB4789.3,GB4789.4,GB/T4789.11,GB7918.4,GB7918.5方法进行。医院消毒灭菌效果监测技术第4页医院消毒卫生标准GB15982-国家标准√ 强制性标准√新旧版主要区分:环境分类、高中低度危险性医疗器材分类、空气采样方法、增加治疗用水检验。重点:4.医院消毒卫生要求附录A采样及检验方法医院消毒灭菌效果监测技术第5页重新划分四类环境Ⅰ类环境：采取空气洁净技术诊疗场所，分洁净手术部和其它洁净场所。Ⅱ类环境：非洁净手术部（室)；产房；导管室；血液病病区、烧伤病区等保护性隔离病区；重症监护病区；新生儿室等。Ⅲ类环境：母婴同室；消毒供给中心检验包装灭菌区和无菌物品存放区；血液透析中心（室)；其它普通住院病区等。IV类环境：普通门（急)诊及其检验、治疗（注射、换药等)室；感染性疾病科门诊和病区。医院消毒灭菌效果监测技术第6页表1各类环境空气、物体表面菌落总数卫生标准环境类别

空气平均菌落数a

物体表面平均菌落数CFU/cm2CFU／皿

CFU/m3

I类环境洁净手术部符合GB50333要求

≤150

≤5．0其它洁净场所≤4.0(30min)b

Ⅱ类环境≤4.0(15min)--≤5．0Ⅲ类环境≤4.0(5min)--≤10．0

Ⅳ类环境≤4.0(5min)--≤10．0

aCFU／皿为平板暴露法，CFU/m3为空气采样器法。b平板暴露法检测时平板暴露时间。怀疑医院感染暴发或疑似暴发与医院环境相关时,

应进行目标微生物检测。医院消毒灭菌效果监测技术第7页高中低度危险性医疗器材分类高度危险性医疗器材criticaldevice/items

进入正常无菌组织、脉管系统或有没有菌体液（如血液)流过，一旦被微生物污染将造成极高感染危险器材。中度危险性医疗器材semi-criticaldevice／items直接或间接接触黏膜器材。低度危险性医疗器材no-criticaldevice/items

仅与完整皮肤接触而不与黏膜接触器材。医院消毒灭菌效果监测技术第8页目录2.消毒灭菌监测检验标准与条件要求

医院消毒灭菌效果监测技术第9页2.医院消毒灭菌监测检验标准检测时限：送检时间，不得超出4h;保留于0℃~4℃时，不得超出24h。相关无菌检验和致病性微生物检测问题说明：不推荐医院常规开展灭菌物品无菌检验，当流行病学调查怀疑医院感染事件与灭菌物品相关时，进行对应物品无菌检验。常规监督检验可不进行致病性微生物检测，包括疑似医院感染暴发、医院感染暴发调查或工作中怀疑微生物污染时，应进行目标微生物检测。

医院消毒灭菌效果监测技术第10页2.医院消毒灭菌监测检验标准试验室要求相对正压洁净条件进行试验。环境要求100级空气洁净试验室、100级空气洁净操作台主要设备P2生物安全柜、生化培养箱、霉菌培养箱、采样箱、干燥箱、高压锅、冰箱、超净台、显微镜、紫外线测定仪、温湿度计、照度计等设备计量认证：仪器、设备、定时计量认证。人员要求监测人员需经过专业培训，掌握一定消毒知识，熟悉消毒设备和药剂性能，具备熟悉检验技能；选择合理采样时间（消毒后、消毒前);遵照严格无菌操作。医院消毒灭菌效果监测技术第11页目录3.医院监测采样、检测及评价方法医院消毒灭菌效果监测技术第12页3.医院监测采样、检测及评价方法空气微生物污染检验物体表面微生物污染检验医务人员手卫生检验灭菌医疗器材检验消毒医疗器材检验使用中消毒液染菌量检验治疗用水检验医疗机构污水检验压力蒸汽灭菌效果监测医院消毒灭菌效果监测技术第13页空气微生物污染检验采样时间Ⅰ类环境在洁净系统自净后与从事医疗活动前采样；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境在消毒或要求通风换气后从事医疗活动前采样采样方法1、Ⅰ类环境参考GB50333；2、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境采取平板暴露法，布点方法需注意。Ⅱ类环境暴露15min，Ⅲ、Ⅳ类环境暴露5min。检测方法将平板放置于37℃培养箱培养48h后计数。平板暴露法按平均每皿菌落数汇报：CFU/（皿·暴露时间）。检测依据GB15982-GB50333-注意事项放置0.8m至1.5m高台面；行走动作轻，降低走动；监测人员穿洁净服，戴口罩，注意手卫生；先布点（放皿），后开盖；采样时将平皿盖打开，扣放于平皿旁；同一房间空气与物表，均由一人操作。评价指标Ⅱ类环境≤4.0CFU／皿

(15min)

；

Ⅲ、Ⅳ类环境≤4.0CFU／皿

(5min)

。详细见表1医院消毒灭菌效果监测技术第14页Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类环境空气微生物采样布点方法(1)室内面积≤30m2，设置内、中、外对角线3个点，内、外布点部位距墙壁1m处。

(2)室内面积>30m2,设4角及中央5点,4角布点部位距离墙壁1m处。医院消毒灭菌效果监测技术第15页医院消毒灭菌效果监测技术第16页物体表面微生物污染检验采样时间潜在污染区、污染区消毒后采样。清洁区依据现场情况确定。采样方法棉拭子法：用5cm×5cm灭菌规格板放在被检物体表面，用浸有0.03mol/L磷酸盐缓冲液或生理盐水采样液无菌棉拭子，在规格板内横竖往返均匀涂抹5次，并随之转动棉拭子，连续采样1～4个规格板面积。剪去手接触部分，并将棉拭子放入装有10ml采样液试管内，马上送检。若采样物体表面有消毒剂残留时，采样液应含对应中和剂。门把等小型物体则采取棉拭子直接在物体表面按一定次序涂抹采样，结果计算用cfu／件表示。检测方法倾注法是指将采样管在混匀器上振荡20s或用力振打80次，用无菌吸管吸收1.0ml待检样品接种于灭菌平皿，每一样本接种2个平皿，内加入已融化45℃～48℃营养琼脂15ml～18ml，边倾注边摇匀，待琼脂凝固，置36℃±1℃温箱培养48h，计数菌落数。检测依据GB15982-注意事项1.采样面积：被采表面＜100/cm²，取全部表面；被采表面>100cm²，取100cm²。2.门把手等不规则物体表面用面拭子直接涂擦采样，用cfu/件表示。3.同一房间空气、物表采样，先采空气，后才物表，最好由一个人操作。4.样品标识一定要清楚，能溯源、追踪，方便整改。5.中和剂选取0.1%硫代硫酸钠生理盐水。评价指标Ⅰ、Ⅱ类环境≤5.0CFU／cm2

；

Ⅲ、Ⅳ类环境≤10.0CFU／cm2

。医院消毒灭菌效果监测技术第17页物体表面棉拭子采样方法医院消毒灭菌效果监测技术第18页医院消毒灭菌效果监测技术第19页-食物、微生物或有机物接触到物体表面，都会留下ATP（三磷酸腺苷)-物体经清洁后，部分残留食物、微生物或其它有机物，经过测定这些残留物细胞内ATP含量，就能够反应出物体清洁度。ATP生物荧光技术ATP快速检测物表清洁评价医院消毒灭菌效果监测技术第20页ATP生物荧光技术-hasbecomethestandardmethodfordeterminingcleanlinesslevelsoncontactsurfacesduringpasttenyears.-Adirectindicatorofpotentialforcontamination.monitoringandverificationofHACCPandSSOP.在过去十年里,ATP荧光快速检测法已经变成一个国际测定物体表面清洁水平标准方法、得到了国际公认。一个直接可视污染监测伎俩得到HACCP和SSOP认可监测和检验伎俩医院消毒灭菌效果监测技术第21页医务人员手卫生检验采样时间采取手卫生后，在接触病人或从事医疗活动前采样。采样方法被检人五指并拢，用浸有含对应中和剂0.03mol/L磷酸盐缓冲液或生理盐水无菌棉拭子在双手指屈面从指根到指端往返涂擦2次（一只手涂擦面积约30㎝2），并随之转动采样棉拭子，剪去操作者手接触部位，将棉拭子投入10ml采样液试管内，马上送检。若采样时手上有消毒剂残留，采样液应含对应中和剂。检测方法倾注法检测依据GB15982-注意事项中和剂选取0.1%硫代硫酸钠生理盐水。卫生手消毒：医务人员用速干手消毒剂揉搓双手，以降低手部暂居菌过程。外科手消毒：外科手术前医务人员用肥皂（皂液）和流动水洗手，再用手消毒剂去除或者杀灭手部暂居菌和降低常居菌过程。使用手消毒剂可含有连续抗菌活性。评价指标卫生手消毒后医务人员手表面菌落总数应≤10cfu/cm2；外科手消毒后医务人员手表面菌落总数应≤5cfu/cm2

。医院消毒灭菌效果监测技术第22页医院消毒灭菌效果监测技术第23页外科手消毒监测采样

2医院消毒灭菌效果监测技术第24页手卫生荧光检测法医院消毒灭菌效果监测技术第25页成品采样管介绍医院消毒灭菌效果监测技术第26页采样方法表3最少检验量灭菌医疗器材检验采样时间在灭菌处理后，存放使用期内采样。检测方法直接接种法即取要求量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基容器中。每个容器中培养基用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨肉汤培养基每管装量不少于10ml。培养14天，并逐日观察。检测依据GB15982-和《中华人民共和国药典》版1101“无菌检验法”注意事项1.在洁净度100级区域中进行，应严格恪守无菌操作，防止微生物污染。2.采样后送检时间不得超出6h，样品保留于4℃，则不超出24h。3.如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂。应采使用期内样品（高压灭菌—2周；环氧乙烷—2年）。4.灭菌后内镜（如腹腔镜、关节镜、胆道镜、膀胱镜、胸腔镜、脑室镜等）应每个月进行生物学监测并做好统计，合格标准为无菌生长。

评价指标高度危险性医疗器材应无菌。无菌判断：将上述接种供试品后培养基容器分别按各培养基要求温度培养14天；培养期间应逐日观察并统计是否有菌生长。如在加人供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有没有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。不然，试验无效。表2：医疗器具供试品：最少检验数量为10（瓶或支)。医院消毒灭菌效果监测技术第27页灭菌医疗器材检验——检验依据1.《中国药典》版1101“无菌检验法”由国家食品药品监管总局6月5日公布（年67号)公告.12.1起实施2.GB15982-

医院消毒灭菌效果监测技术第28页《中国药典》章节介绍无菌检验法对象与环境培养基及其适用性检验（无菌性检验和灵敏度检验)（更换新批次培养基时需做)稀释液、冲洗液及其制备方法（如对不能用破坏性方法取样特殊医疗用具采样过程中需使用)方法适用性试验（每碰到新样品类型时做)供试品无菌检验（包含薄膜过滤法和直接接种法)：如薄膜过滤法主要检测水溶液供试品与注射用药品等，对于小型灭菌医用器具、敷料、针灸针、肠线、缝合线等供试品使用直接接种法为宜。结果判断检测量表医院消毒灭菌效果监测技术第29页

药典无菌检验法增、修订内容1、方法应用范围增加“生物制品”。2、试验环境修订。3、培养基体系修订。4、检验方法整合修订。5.参考USP对表2、表3整合修订。←版《中国药典》版《中国药典》→无菌检验法对象医院消毒灭菌效果监测技术第30页无菌检验环境要求：

应在洁净度10000级背景下局部100级单向流空气区域内或隔离系统进行。无菌检验

在无菌条件下进行试验，环境必须抵达无菌检验要求。环境要求：该项检验应在环境洁净度万级（C级)背景下局部百级（A级)单向流区域内或隔离系统中进行。其全过程必须严格恪守无菌操作。预防微生物污染，但所采取方法不得影响供试品中微生物检出。操作前环境洁净度应经验证。日常检验需对试验环境进行监控。无菌检验试验环境修订医院消毒灭菌效果监测技术第31页无菌室要求医院消毒灭菌效果监测技术第32页

1.硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃2.改良马丁培养基23～28℃培养。3.选择性培养基4.0.5%葡萄糖肉汤培养基5.营养肉汤培养基6.营养琼脂培养基7.改良马丁琼脂培养基1.硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃；20～25℃培养（生)2.胰酪大豆胨肉汤培养基20～25℃培养。3.选择性培养基4.0.5%葡萄糖肉汤培养基5.胰酪大豆胨琼脂培养基6.沙氏葡萄糖肉汤培养基7.沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基增修订内容医院消毒灭菌效果监测技术第33页无菌检验培养基按商品说明称取培养基配制，若干燥培养基结块应勿使用。硫乙醇酸盐流体培养基：按商品说明称取培养基，配制，摇匀，分装，按培养基说明高压灭菌，保留备用。分装容器应适当，其装量与容器高度百分比应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色)不超出培养基深度1/2。供试品接种前，培养基氧化层高度不得超出培养基深度1/5，不然须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超出20分钟)，快速冷却只限加热一次，并应预防被污染。医院消毒灭菌效果监测技术第34页无菌检验之培养基适用性检验意义：无菌检査用硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基无菌性检査及灵敏度检査要求。本检验可在供试品无菌检査前或与供试品无菌检査同时进行。（时间)无菌性检验每批培养基随机取不少于5支(瓶)，置各培养基要求温度培养14天，应无菌生长。灵敏度检査菌种培养基灵敏度检验所用菌株传代次数不得超出5代(从菌种保留中心取得干燥菌种为第0代)，并采取适宜菌种保藏技术进行保留，以确保试验菌株生物学特征。步骤：菌种——菌液制备——培养基接种——④结果判定医院消毒灭菌效果监测技术第35页培养基灵敏度检验①试验菌株修订

硫乙醇酸盐流体培养基金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌改良马丁培养基白色念珠菌、黑曲霉

硫乙醇酸盐流体培养基:金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]、生孢梭菌[CMCC(B)64941];胰酪大豆胨液体培养基:枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]医院消毒灭菌效果监测技术第36页灵敏度检査②菌液制备用培养基1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至营养肉汤培养基培养基2、接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌新鲜培养物至改良马丁培养基4.接种黑曲霉新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上

1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基2、接种生孢梭菌新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基3、接种白色念珠菌新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基4.接种黑曲霉新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基医院消毒灭菌效果监测技术第37页灵敏度检査培养基接种：取每管装量为12ml硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天;取每管装量为9ml胰酪大豆胨液体培养基7支，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。逐日观察结果。④结果判定：空白对照管应无菌生长，若加菌培养基管均生长良好，判该培养基灵敏度检验符合要求。医院消毒灭菌效果监测技术第38页方法适用性试验意义：进行产品无菌检验时，应进行方法适用性试验，以确认所采取方法适合于该产品无菌检验。若检验程序或产品发生改变可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。方法适用性试验按"供试品无菌检验”要求及以下要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行方法确认。方法适用性试验也可与供试品无菌检验同时进行。结果判断：与对照管比较，如含供试品各容器中试验菌均生长良好，则说明供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用能够忽略不计，照此检査方法和检验条件进行供试品无菌检验。如含供试品任一容器中试验菌生长微弱、迟缓或不生长，则说明供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采取增加冲洗量、增加培养基用量、使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品抑菌作用，并重新进行方法适用性试验。医院消毒灭菌效果监测技术第39页

硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100cfu金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌改良马丁培养基接入小于100cfu白色念珠菌、黑曲霉。硫乙醇酸盐流体培养基接入小于100CFU金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌CCMCC(B)44102.生孢梭菌各2管；胰酪大豆胨液体培养基接入小于100CFU枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管。培养时间不得超出5天。方法适用性试验修订医院消毒灭菌效果监测技术第40页采样方法表3最少检验量灭菌医疗器材检验采样时间在灭菌处理后，存放使用期内采样。检测方法直接接种法即取要求量供试品分别接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基容器中。每个容器中培养基用量应符合接种供试品体积不得大于培养基体积10%，同时，硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15ml，胰酪大豆胨肉汤培养基每管装量不少于10ml。培养14天，并逐日观察。检测依据GB15982-和《中华人民共和国药典》版1101“无菌检验法”注意事项1.在洁净度100级区域中进行，应严格恪守无菌操作，防止微生物污染。2.采样后送检时间不得超出6h，样品保留于4℃，则不超出24h。3.如消毒因子为消毒剂，采样液中应加入中和剂。应采使用期内样品（高压灭菌—2周；环氧乙烷—2年）。4.灭菌后内镜（如腹腔镜、关节镜、胆道镜、膀胱镜、胸腔镜、脑室镜等）应每个月进行生物学监测并做好统计，合格标准为无菌生长。

评价指标高度危险性医疗器材应无菌。无菌判断：将上述接种供试品后培养基容器分别按各培养基要求温度培养14天；培养期间应逐日观察并统计是否有菌生长。如在加人供试品后或在培养过程中，培养基出现浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有没有微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基中，培养3天，观察接种同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。不然，试验无效。表2：医疗器具供试品：最少检验数量为10（瓶或支)。医院消毒灭菌效果监测技术第41页灭菌医疗器材检验——样本制备样品类型样本制备方法可用破坏性方法取样1.敷料类等非管道类样品取2个包装内样本，剪成约10mm×30mm大小样片21片，接种含硫乙醇酸盐流体培养管5管与胰酪大豆胨肉汤培养管2管。每培养管含培养基40mL，各接种3片样片。2.注射针、针灸针、缝合针、棉签等小样本可直接接种含硫乙醇酸盐流体培养管5管与胰酪大豆胨肉汤培养管2管。每管含培养基15mL。3.输液（血）器等导管类样本选7支样本，以无菌注射器吸收5.0mL-10.0mL无菌洗脱液注入管内往返摇荡5次。将样本洗脱液分别接种含硫乙醇酸盐流体培养管5管与胰酪大豆胨肉汤培养管2管。培养管含培养基15mL，每管接种样本洗脱液1.0mL。不能用破坏性方法取样医疗器材应在环境洁净度10000级下局部洁净度100级单向流空气区域内或隔离系统中，用浸有没有菌生理盐水采样液棉拭子在被检物体表面涂抹，采样取全部表面或不少于100cm2；然后将除去手接触部分棉拭子进行无菌检验。牙科手机环境同上，将每支手机分别置于含20至25mL采样液无菌大试管（内径25mm）中，页面高度应大于4.0cm，于旋涡混合器上洗涤震荡30s以上，取洗脱液进行无菌检验。医院消毒灭菌效果监测技术第42页灭菌医疗器材检验——对照与培养培养条件：1.硫乙醇酸盐流体培养基30～35℃2.胰酪大豆胨肉汤培养基20～25℃培养阳性对照：应依据供试品特征选择阳性对照菌：无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌;抗革兰阴性菌为主供试品以大肠埃希菌为对照菌;抗厌氧菌供试品，以生孢梭菌为对照菌;抗真菌供试品，以白色念珠菌为对照菌。阳性对照试验菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100cfu，供试品用量同供试品无菌检验时每份培养基接种样品量。阳性对照管培养72h内应生长良好。阴性对照:供试品无菌检验时，应取对应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。医院消毒灭菌效果监测技术第43页医院消毒灭菌效果监测技术第44页采样与检测方法消毒医疗器材检验采样时间在消毒处理后，存放使用期内采样。检测依据GB15982-和《内镜清洗消毒技术操作规范》（年版）注意事项1.消毒剂浓度监测每日定时监测并做好统计，确保消毒效果。消毒剂使用时间不得超出产品说明书要求使用期限。2.消毒后内镜（如胃镜、肠镜、喉镜、气管镜、鼻窦镜等）应每季度进行生物学监测并做好监测统计。3.采样时，尽可能用大小一致无菌棉签，并将棉签经过采样管壁挤压，去除多出采样液，使之处于湿润状态，而不是浸泡状态，然后按30°角度轻轻地有序地用力均匀地涂抹采样品，禁用干棉签采样。评价指标中度危险性医疗器材：菌落总数应≤20cfu/件（/g或/100cm2）,不得检出致病性微生物。

低度危险性医疗器材：菌落总数应≤200cfu/件（/g或/100cm2）,不得检出致病性微生物。详见下页医院消毒灭菌效果监测技术第45页消毒医疗器材检验——样本制备样品类型样本制备方法可整件放入无菌试管用洗脱液浸没后震荡30s以上,取洗脱液1.0mL接种平皿，将冷至40℃～45℃熔化营养琼脂培养基每皿倾注15mL～20mL，36℃±1℃恒温箱培养48h，计数菌落数（cfu/件），必要时分离致病性微生物。可用破坏性方法取样在100级超净工作台称取1g～10g样品，放入装有10mL采样液试管内进行洗脱，取洗脱液1.0mL接种平皿，计数菌落数（cfu/g），必要时分离致病性微生物。不可用破坏性方法取样在100级超净工作台，用浸有没有菌生理盐水采样液棉拭子在被检物体表面涂抹采样，被采表面＜100cm2，取全部表面，被采表面≥100cm2，取100cm2，然后将除去手接触部分棉拭子进行洗脱，取洗脱液1.0mL接种平皿，用营养琼脂培养基倾注，36℃±1℃恒温箱培养48h，计数菌落数（cfu/cm2），必要时分离致病性微生物。消毒后内镜取清洗消毒后内镜，采取无菌注射器抽取50mL含对应中和剂洗脱液，从活检口注入冲洗内镜管路，并全量搜集（可使用蠕动泵）送检。混匀后取洗脱液倾皿培养。将剩下洗脱液在无菌条件下采取滤膜（0.45μm）过滤浓缩，将滤膜接种于凝固营养琼脂平板上（注意不要产生气泡），培养计数。医院消毒灭菌效果监测技术第46页消毒后内镜采样方法采样前准备无菌手套，80mL容量螺口瓶，及中和剂。螺口瓶我们用是"HXBL”和星玻璃，能够高温高压，刻度为80mL。采样前需要瓶口酒精灯烧灼消毒

。特此感激陆烨提供相关资料。医院消毒灭菌效果监测技术第47页消毒后内镜采样方法（2)抽取中和剂，需要用50mL一次性注射器抽取，注意无菌操作。将中和剂从内镜注水口缓缓注入，防止喷溅，注意无菌操作，手不能接触到"推柱”内侧。同时将出水端放入螺口瓶中，注意不要污染。

特此感激陆烨提供相关资料。

医院消毒灭菌效果监测技术第48页培养方法:倾皿法和滤膜法。消毒医疗器材检验结果计算49必要时分离致病微生物：将送检液用旋涡器充分震荡，取0.2ml分别接种90mm血平皿、中国兰平皿和SS平皿，均匀涂布（L型玻璃涂布棒)，35℃培养48小时，观察有没有致病菌生长。医院消毒灭菌效果监测技术第49页消毒剂检验方法

库存消毒剂有效成份含量应依照《消毒技术规范》或产品企业标准进行检测。

使用中消毒液使用中消毒液有效浓度测定可用前述方法，也可使用经国家卫生行政部门同意消毒剂浓度试纸（卡)进行监测。1.消毒剂有效成份含量检验方法2.使用中消毒液染菌量检验详见后页医院消毒灭菌效果监测技术第50页使用中消毒液染菌量检验采样时间采取更换前使用中消毒液与无菌器械保留液。采样方法用无菌吸管（或一次性灭菌注射器2.0ml-2.5ml）吸收消毒液1.0ml，加入到9.0ml含对应中和剂无菌肉汤采样管中混匀。检测方法倾注法，用无菌吸管吸收一定稀释百分比中和后混合液1.0mL接种平皿，用营养琼脂培养基倾注，36℃±1℃恒温箱培养72h，计数菌落数；必要时分离致病性微生物（金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、铜绿假单胞菌）。消毒液染菌量（cfu/ml）=每个平板上菌落数×10×稀释倍数检测依据GB15982-、GB27951-、GB27954-、

《消毒技术规范》版3.17.9.2注意事项1.采集消毒液样品时应在消毒液内没有物品或放入物品消毒作用到要求时间之后进行采样。2.不一样消毒剂使用与之相对应中和剂中和，以中和被检液残效作用。3.样品标识一定要清楚，不但要注明采样地点，且需要注明消毒液名称和有效浓度等信息，确保唯一性。如：该院13手术室洁冠牌75%乙醇消毒液（0902）常德市汉辅医用消毒剂有限企业。评价指标灭菌用消毒液菌落总数应为0cfu/mL；皮肤粘膜消毒液菌落总数应符合相关标准要求（如GB27951-皮肤消毒剂卫生要求）；其它使用中消毒液菌落总数≤100cfu/mL，不得检出致病性微生物。医院消毒灭菌效果监测技术第51页消毒液与相对应中和剂参考表52消毒液类别醇酚类含氯、含碘、过氧化物氯己定（洗必泰）季胺盐类醛类含有表面活性剂各种复方消毒液对应中和剂普通营养肉汤在肉汤中加入中和剂0.1%硫代硫酸钠在肉汤中加入3%（w/v）吐温80和0.3%卵磷脂在肉汤中加入0.3%甘氨酸在肉汤中加入3%（w/v）吐温80医院消毒灭菌效果监测技术第52页皮肤消毒剂卫生要求GB27951-本标准适合用于完整皮肤和破损皮肤消毒消毒剂，不适合用于手消毒剂。完整皮肤惯用消毒剂种类：醇、碘、胍、季铵盐、酚、过氧化物等。微生物污染指标：完整皮肤消毒剂菌落总数

≤10cfu/mL(g)，霉菌和酵母菌≤10cfu/mL(g)，不得检出致病菌;破损皮肤消毒剂应无菌。禁用、限量：铅汞砷医院消毒灭菌效果监测技术第53页使用中消毒液染菌量评价标准总结：灭菌用消毒液菌落总数应为0cfu/ml;破损皮肤消毒剂菌落总数应为0cfu/ml;完整皮肤黏膜消毒液菌落总数应≤10cfu/ml;其它使用中消毒液菌落总数应≤100cfu/ml。致病菌：不得检出。

医院消毒灭菌效果监测技术第54页检测方法1.应采取常规微生物检验方法(倾注平板法)取得细菌总数计数(标准培养皿计数)。培养基应为胰蛋白酶大豆琼脂或等价物，计算菌落数目应在35℃~37℃下培养48h后进行。48h后若呈阴性，可于72h后再检验。这是标准操作方法。2.应用鲎试剂法检验内毒素，测定是否有致热原。治疗用水检验采样时间每个月1次。若采样结果超标时，须重复检验，怀疑或确定病人在治疗中有热原反应和菌血症时，应随时检测。采样方法应在按百分比配制透析液装置入口处或在混合罐入口处，搜集处理水试样。检测依据血液透析相关治疗用水YY0572-中国药典年版1143细菌内毒素检验法注意事项试样应在搜集后30min内进行化验，或马上放在1℃~5℃下储存，并按常规程序在搜集后24h内化验。评价指标1.处理水所含细菌总数，应不得超出100CFU/mL

。2.在水处理装置输出端细菌内毒素，应不得超出1EU/mL;在血液透析装置人口输送点上细菌内毒素，应不得超出5EU/mL

。医院消毒灭菌效果监测技术第55页5医院消毒灭菌效果监测技术第56页医院消毒灭菌效果监测技术第57页检测方法鲎试剂2支（阴性对照管）+各100ul细菌内毒素检验用水+各100ul无热原水→37℃1h；鲎试剂2支（阳性对照管）+各100ul细菌内毒素检验用水+各100ul标准品稀释液→37℃1h；鲎试剂2支（样品阳性对照管）+各100ul标准品稀释液+各100ul样液→37℃1h。鲎试剂2支（样品管）+各100ul细菌内毒素检验用水+各100ul样液→37℃1h。共8支鲎试剂，封闭管口，震荡混匀试管内容物，垂直放入37±1℃水浴中保温60±2min，温育期间防止振动，轻轻取出，观察结果。细菌内毒素检验（凝胶限量试验)方法类别细菌内毒素检验法包含两种方法，即凝胶法和光度测定法。凝胶法分为限量试验和半定量试验，适合用于：一次性使用输液器、输血器、注射器、透析水。试验条件100级洁净室或100级超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、电热干燥箱、漩涡混合器。注意事项当测定结果有争议时，除另有要求外，以凝胶程度试验结果为准。结果判定1、将恒温器中取出试管迟缓倒转180°，管内容物呈坚实凝胶者为阳性，统计为（+），不呈凝胶状或虽呈凝胶状但不能保持完整并从管壁滑脱者为阴性，统计为（-）。

2、阳性对照2管和供试管阳性对照2管均应均为（+），阴性对照2管应均为（-），供试品2管均为（-）性时，试验有效，判定产品符合本法要求，不再进行热原试验。

医院消毒灭菌效果监测技术第58页试验器械移液管（或刻度吸管、微量加样器及无热原吸头)、凝集管（10×75mm)、试管、试管架、洗耳球、封口膜、计时器、75%酒精棉、剪刀、砂轮。试验所用器皿需经处理，以去除可能存在外源性内毒素。惯用方法是在250℃干烤最少30分钟，也可采取其它确证不干扰细菌内毒素检验适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套吸头等，应选取标明无内毒素而且对试验无干扰器械。试验操作过程应预防微生物是污染。试验准备

医院消毒灭菌效果监测技术第59页医院消毒灭菌效果监测技术第60页试验操作:细菌内毒素国家标准品稀释制备：取细菌内毒素国家标准品或工作标准品一支，加入要求量细菌内毒素检验用水溶解其内容物，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器上混合15分钟。然后进行稀释，制备成4个浓度细菌内毒素标准溶液,即2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ（λ为所复核鲎试剂标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。医院消毒灭菌效果监测技术第61页坚实凝胶阳性"+”医院消毒灭菌效果监测技术第62页未形成凝胶

凝胶不坚实阴性"—”医院消毒灭菌效果监测技术第63页供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○○●●○○●●供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照●●●●○○●●凝胶限量试验结果判断此透析用水内毒素含量小于1EU/ml或者5EU/ml,符合要求此透析用水内毒素含量大于1EU/ml或者5EU/ml,不符合要求医院消毒灭菌效果监测技术第64页凝胶限量试验结果判断供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○●●●○○●●复试时，供试品溶液需做4支平行管，若全部平行管均为阴性，判供试品符合要求;四管中如有一管为阳性，即可判供试品不符合要求。供试品溶液供试品阳性对照阴性对照阳性对照○○○○●●○○●●须复试医院消毒灭菌效果监测技术第65页医疗机构污水检验监测频率总余氯：采取含氯消毒剂消毒时，接触池出口总余氯每日监测不得少于2次（采取间歇式消毒处理，每次排放前监测）。粪大肠菌群：每个月检测不得少于1次。致病菌：检测沙门菌（每季度不少于1次）和志贺菌（每年不少于2次），结核病医疗机构应依据需要检测结核杆菌。采样方法污水监测项目：总余氯、粪大肠菌群、肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌）；结核病医疗机构增测结核杆菌。检测依据GB18466-.附录A、B、C、E注意事项标准4.1.2中明确指出：排入终端已建有正常运行城镇二级污水处理厂下水道污水，执行预处理标准。评价指标参考GB18466-：详见后页

医院消毒灭菌效果监测技术第66页医疗机构水污染排放限值医院类型分类总余氯粪大肠菌群传染病、结核病医疗机构采取含氯消毒剂消毒消毒接触池接触时间≧1.5h,接触池出口总余氯6.5~10mg／L≤100MPN／L采取其它消毒剂消毒不做要求≤100MPN／L综合性医疗机构采取含氯消毒剂消毒排放标准消毒接触池接触时间≧1h,接触池出口总余氯3~10mg／L≤500MPN／L预处理标准消毒接触池接触时间≧1h,接触池出口总余氯2~8mg／L≤5000MPN／L采取其它消毒剂消毒排放标准不做要求≤500MPN／L预处理标准不做要求≤5000MPN／L肠道致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、结核杆菌)均不得检出。医院消毒灭菌效果监测技术第67页总余氯检测——邻联甲苯胺比色法1日常监测普通采取比色计：在含5ml样品比色管内滴加邻联甲苯胺溶液2滴～3滴，混匀，置暗处15min，与永久性余氯标准比色