专题强化练44基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建

专题强化练44基因工程中限制酶的选取与基因表达载体的构建授课提示：对应专题强化练126页(分值：65分)一、选择题(每题2分，共计4分)1．(2025·山东泰安二模)双向启动子可同时结合两个RNA聚合酶来驱动下游基因的表达，研究人员构建了如图所示的表达载体，以检测双向启动子作用效果。下列分析正确的是()A．表达载体中GUS基因和LUC基因转录时使用同一条DNA单链为模板B．为连入GUS基因，需用SalⅠ和SphⅠ切割已整合了双向启动子及LUC基因的质粒C.在培养基中添加壮观霉素可筛选出成功导入表达载体的受体细胞D．通过观察是否出现荧光和蓝色物质可检测双向启动子的作用效果解析：转录是从子链(mRNA)5′→3′方向进行的，由题图可知，双向启动子位于GUS基因和LUC基因之间，所以GUS基因和LUC基因转录时的模板链不是DNA分子的同一条链，A错误；如果用SphⅠ切割已整合了双向启动子及LUC基因的质粒，就会破坏LUC基因，B错误；T-DNA中含有潮霉素抗性基因，而不包含壮观霉素抗性基因，因此可以通过在培养基中添加潮霉素来筛选成功导入表达载体的受体细胞，C错误；双向启动子如果正常表达，就会合成荧光素酶和β-葡萄糖苷酶，催化底物分别产生荧光或生成蓝色物质，从而确定双向启动子的作用，D正确。答案：D2．(2025·江西九江二模)(不定项)下图甲、乙所示为Ti质粒和含S基因的DNA片段及一些酶切位点，图中所示的限制酶切割位点及其所产生的末端都不相同。下列说法正确的是()A．最好选用XbaⅠ和HindⅢ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒B．PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的5′端C．S基因应插入到Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间D．基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端都不相同解析：结合题图可知，最好选用XbaⅠ和HindⅢ切割含S基因的DNA片段和Ti质粒，这样可以在目的基因的两端形成不同的黏性末端，同时这两个限制酶在质粒的T-DNA中有这两个限制酶的识别序列各一个，进而可以保证目的基因的正向连接，A正确；PCR扩增S基因时，引物结合在S基因两条链的3′端，因为引物上子链的延伸方向是5′→3′，且引物和模板链是反向平行的，B错误；S基因应插入到Ti质粒T-DNA的启动子与终止子之间，这样可以保证目的基因的转移和表达，C正确；基因工程中使用的各种限制酶切割DNA所形成的末端可能相同，即存在同尾酶，D错误。答案：AC二、非选择题(61分)3．(14分)(2025·山东聊城一模)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原(vtg)基因(如图甲所示)的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。为了实现可视化监测，科学家将斑马鱼的vtg基因，与人工构建的含萤火虫荧光素酶基因(无启动子)的载体(如图乙所示)连接，形成vtg-Luc基因重组载体，成功培育了转基因斑马鱼。图乙中Luc表示萤火虫荧光素酶基因，可以催化荧光素氧化产生荧光；AmpR为氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因，BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ为限制酶。(1)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，可选用限制酶________进行双酶切Luc基因载体，其优点是__________________________________________。(2)为使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体，通过PCR技术扩增vtg基因时，需设计合适的加端引物。依据图甲、图乙信息推测引物2包含的碱基序列为5′-______________-3′。一个vtg基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为________。(3)若筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选__________________________________________的大肠杆菌即为目的菌；若要判断斑马鱼转基因是否成功，可在水体中添加________________进行检测。解析：(1)要使vtg基因与Luc基因载体形成重组载体并降低“空载”概率，应选用两种不同的限制酶进行双酶切。观察图乙，EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点分别位于Luc基因载体的不同位置，用这两种酶双酶切可以满足要求，可以防止质粒和目的基因的自身环化及目的基因的反向连接。(2)引物2要与vtg基因的模板链互补配对，并且要包含与Luc基因载体双酶切后相同的黏性末端(HindⅢ的黏性末端)。根据图甲中vtg基因的序列以及图乙中HindⅢ的识别序列，引物2包含的碱基序列为5′-AAGCTTAGAGGC-3′；一个vtg基因经过4轮循环后，共得到24＝16个DNA分子。其中只含有1种引物的DNA分子有2个，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为18。(3)重组载体中含有氨苄青霉素抗性基因，而四环素抗性基因因酶切被破坏，所以导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌能在含有氨苄青霉素的培养基中生长，不能在含有四环素的培养基中生长，筛选能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌；水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白，激活卵黄蛋白原(vtg)基因的表达，因此斑马鱼可用于监测环境雌激素污染程度。因为转基因斑马鱼含有萤火虫荧光素酶基因，该酶可以催化荧光素氧化产生荧光，所以若要判断斑马鱼转基因是否成功，答案：(1)EcoRⅠ、HindⅢ防止质粒和目的基因的自身环化及目的基因的反向连接(2)AAGCTTAGAGGC18(3)能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长4．(15分)(2025·河北保定一模)由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员利用基因工程技术培育出了高表达P蛋白的转基因玉米，图甲表示P基因片段和农杆菌的Ti质粒及几种限制酶的识别序列和切割位点。回答下列问题：(1)若b链为P基因转录的模板链，则扩增P基因时，应选择的引物是________________。构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用的两种酶为________________。(2)用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含________的培养基中进行筛选。科研人员进一步用PCR验证P基因是否成功导入玉米细胞，电泳结果如图乙所示。其中①为P基因，作为阳性对照，②为阴性对照，③为检测结果，由此可验证________________________。(3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，可用________________技术进行检测。(4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有__________________(填植物激素)的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是______________________________________________________________。解析：(1)启动子在基因的左边，b链为P基因转录的模板链，则b链的5′端在右边，3′端在左边；a链的5′端在左边，3′端在右边。引物结合在模板链的3′端，所以选择的引物应该为引物2和引物3。构建基因表达载体时，切割Ti质粒的其中一种限制酶不能选用XbaⅠ，因为XbaⅠ在终止子以外，故限制酶只能在EcoRⅠ、SpeⅠ及MunⅠ中选择。MunⅠ在T-DNA的边界序列以外，故应该选择EcoRⅠ和SpeⅠ。(2)潮霉素抗性基因位于T-DNA内，用含重组Ti质粒的农杆菌侵染玉米后，应在含潮霉素的培养基中筛选出含P基因的玉米细胞。经过电泳图谱比较，③待测玉米细胞中有一条条带与①的阳性对照相同，说明P基因成功导入了玉米细胞。(3)为了验证玉米植株中是否成功表达出P蛋白，常用抗原—抗体杂交技术进行检测。(4)侵染后的玉米外植体需要先进行脱分化，然后在含有生长素和细胞分裂素等的培养基上诱导生根和生芽。从遗传学的角度看，玉米外植体能形成完整植株的原因是玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息。答案：(1)引物2和引物3EcoRⅠ和SpeⅠ(2)潮霉素P基因成功导入了玉米细胞(3)抗原—抗体杂交(4)生长素、细胞分裂素玉米外植体细胞含有发育成完整个体的全部遗传信息5．(16分)(2025·内蒙古阿拉善盟一模)双乙酰是啤酒中的主要风味物质，含量过高会影响啤酒的品质；谷胱甘肽可以提高啤酒的抗老化能力。研究发现，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，GSH1基因编码谷胱甘肽合成中的关键酶。为生产低双乙酰且抗老化的啤酒，科研人员运用基因工程技术制备啤酒酵母工程菌，过程如图，其中CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性。请分析回答：(1)分析图甲可知，需用______________(填限制酶名称)切割质粒1以获取CUP1基因。(2)转化后的啤酒酵母应置于含____________的培养基中进行初步筛选。(3)进一步鉴定需要以转化后啤酒酵母的______________为模板，用图示两种引物进行PCR扩增。若扩增产物的大小约为1300bp，则说明______________基因已整合到啤酒酵母的染色体上。(4)将啤酒酵母工程菌与未转化的受体菌分别置于麦芽汁培养基中培养，定期取样检测，结果如图乙。据图乙分析，啤酒酵母工程菌抗老化能力________。啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显__________未转化的受体菌，原因是________________________________________________________________________。解析：(1)观察图甲中质粒1的结构，CUP1基因两端的限制酶切割位点分别为SalⅠ和BglⅡ，所以要用SalⅠ和BglⅡ切割质粒1，才能将CUP1基因完整地从质粒1上切割下来。(2)由题意“CUP1基因的表达产物可使细胞对一定浓度的硫酸铜产生抗性”可知，转化后的啤酒酵母应置于含一定浓度的硫酸铜的培养基中进行初步筛选，这样就可以筛选出转化后含有CUP1基因的啤酒酵母，只有成功导入并表达CUP1基因的啤酒酵母才能在含铜离子的培养基中生存。(3)进一步鉴定需要检测目的基因是否整合到啤酒酵母的染色体上，所以应以转化后啤酒酵母的总DNA为模板，因为啤酒酵母的总DNA包含了可能整合进去的CUP1基因等所有遗传物质；由图甲可知，用KpnⅠ和PstⅠ处理重组质粒后导入啤酒酵母的片段含有CUP1基因和GSH1基因。已知CUP1基因大小为1028bp，引物1到引物2之间还包含ILV2-左部分片段(270bp)，1028＋270＝1298，约为1300bp，因此扩增产物的大小约为1300bp则说明CUP1基因导入啤酒酵母的染色体上，也说明CUP1基因和GSH1基因已整合到啤酒酵母的染色体上。(4)由题意可知，谷胱甘肽含量越高，抗老化能力越强。从图乙可以看出，工程菌的谷胱甘肽含量高于未转化的受体菌，所以啤酒酵母工程菌抗老化能力增强；由图乙可知，啤酒酵母工程菌的双乙酰合成量明显低于未转化的受体菌，由题意可知，ILV2基因编码双乙酰合成中的关键酶，如果转化的啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏，就不能编码双乙酰合成中的关键酶，从而使工程菌的双乙酰合成量降低。答案：(1)BglⅡ和SalⅠ(2)一定浓度的硫酸铜(3)总DNACUP1基因和GSH1(4)增强低于啤酒酵母工程菌的ILV2基因被破坏6．(16分)(2025·河北石家庄二模)农业生产中大量使用有机磷农药导致水体遭到了严重的污染。研究人员将源于施氏假单胞菌YC-YH1的降解酶基因mpd和ophc2插入苦草(一种沉水植物)染色体中，让转基因植物降解水体中的有机磷农药。下图是获得转基因苦草的基因工程操作程序，图甲所示基因mpd和ophc2与引物结合位点及模板链分布情况。请回答下列问题：(1)现需将基因mpd和ophc2通过PCR技术进行扩增，在扩增基因时，需要根据______________________________________________设计特异性引物序列，引物的作用是________________________________________________________________________。(2)据图分析，将基因mpd和ophc2拼接成融合基因，基因mpd的a链的5′端与基因ophc2的________(填“a链”或“b链”)的3′端相连，理由是________________________________________________________________________。(3)利用基因工程获得转基因植物的核心步骤为：__________________，据图乙分析，该过程需要选择限制酶________________切割融合基因。(4)将受体细胞接种到添加卡那霉素的培养基中进行培养，卡那霉素的作用是__________________________________________________，将筛选出的受体细胞经组织培养获得植株，但成功导入融合基因的植株不一定能降解有机磷农药，原因是_______________________________________________________________________