CN119517167A 分析食管鳞状细胞癌的肿瘤微环境的方法 （杭州茵菲多组学生物科技有限公司）

道奔竞大道3300号生命科学科创中心本申请公开了分析食管鳞状细胞癌的肿瘤淋巴结构及其邻域并确定免疫细胞占比和关键21.一种食管鳞状细胞癌患者的干预效果的预测和/或诊断分析方法，其特征在于，包2.一种分析食管鳞状细胞癌的肿瘤微环境(TME)的方法，其特征在于，所述的方法包选定肿瘤微环境中待分析的基本组织结构蛋白；其中，所述基本组织结进行细胞分割及蛋白表达水平提取，包括如下步骤：基于细胞核识别三级淋巴结构及其邻域并确定免疫细胞占比和关键功能蛋小定义并识别相邻细胞，根据一定数量相邻的B细胞构成的空间结构单元定义并识别三级识别组织区域及其邻域并确定不同细胞占比和关键功能蛋白的确定所述肿瘤微环境中的细胞_细胞间空间互作：基于对细胞类型的定义及其空间位1）源自上皮细胞的基本组织结构蛋白选自：35.如权利要求2或权利要求3所述的方法6.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其特征在于，所述初始聚类使用选自：由7.如权利要求2或权利要求3所述的方法，其8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述免疫耗竭相关标志物选自：由PD_1、水平是否为预测食管鳞状细胞癌的干预效果的预或者，据成像质谱细胞术的检测分析结果判断所述肿45仅为15%_25%。新辅助化学免疫治疗旨在通过重新激活对肿瘤细胞的免疫反应来减少肿瘤+T细胞和B细胞中免疫检查点相关分子的表达水平，以及纤维化与上皮交界区域中6部位的药物积累增加。此外，它还被观察到可以减少肿瘤微环境（TME）中的调节性T细胞时减少其系统毒性。其纳入组合是基于其抑制胸苷酸合成酶的能力，导致增殖肿瘤细胞的疫治疗剂的疗效。通过利用这些药物的单独作用机制，旨在以互补的方式拆除肿瘤对免疫网络不仅通过分泌细胞因子和生长因子支持肿瘤生长和转移，还通过免疫逃逸和ECM重塑[0011]本研究的主要目的是通过使用先进的IMC技术阐明ESCC的空间蛋白质组学景观，旨在识别预测化学免疫治疗反应的TME特征。其次，寻求利用这些见解来定制靶向治疗策CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平的试剂1和样本中炎症性巨噬细胞的含量的细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平的试剂1和样本中C1QC+巨噬细胞的免疫检查点分7[0019]在一些实施方式中，所述炎症性巨噬细胞选自上皮与成纤维交界区C1QC+巨噬细[0020]在一些实施方式中，所述试剂1为检测所述耗竭标志物含量或其表达水平的特异[0023]在一些实施方式中，所述试剂2包括检测纤维化区域中S100A9+的巨噬细胞的[0024]在一些实施方式中，检测样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达[0026]在一些实施方式中，所述预测因子的样本来源为食管鳞状细胞癌患者的肿瘤组[0033]在一些实施方式中，所述试剂盒包含用于检测样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平的试剂1和样本中C1QC+的巨噬细胞的免疫检查点分子的表达水[0035]在本申请的第三方面，提供一种食管鳞状细胞癌患者的干预效果的预测和/或诊耗竭标志物的含量或其表达水平和样本中炎症含量或其表达水平和样本中C1QC+的巨噬细胞的免疫检查点分子的表达水平8[0043]在本申请的第四方面，提供一种预测食管鳞状细胞癌干预效果的模型的构建方[0044]获取样本中预测因子的检测数据；所述预测因子至少包括样本中功能性CD8T细[0051]在一些实施方式中，所述炎症性巨噬细胞选自上皮与成纤维交界区域C1QC+巨噬[0052]在一些实施方式中，所述检测数据包括功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或[0053]在一些实施方式中，通过检测所述耗竭标志物含量或其表达水平的特异性引物、特异性探针和抗体中的一种或多种获得所述耗竭标志物的含性探针和抗体中的一种或多种获得所述炎症性巨[0055]在一些实施方式中，所述获取功能性CD8T细胞的耗竭标志物的检测数据于干预[0062]在本申请的第五方面，提供一种用于预测食管鳞状细胞癌患者的干预效果的系9[0063]数据处理模块，用于将接收或输入的样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含[0066]数据处理模块，用于将接收或输入的样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含[0072]在本申请的第八方面，提供一种用于预测食管鳞状细胞癌患者的干预效果的装[0074]检测分析免疫细胞在三级淋巴结构中的空间排列以及食管鳞状细胞癌组织中的[0097]在一些实施方式中，所述方法还包括根据分析结果建立干预期间肿瘤微环境的大小定义并识别相邻细胞，根据一定数量相邻的B细胞构成的空间结构单元定义并识别三级淋巴结构，根据所述三级淋巴结构边界外围一定距离的区域定义并识别其对应的邻[0123]确定所述肿瘤微环境中的细胞_细胞间空间互作：基于对细胞类型的定义及其空[0124]本申请一实施方式中的试验展示了一种新型新辅助化学免疫治疗方案在食管鳞[0127]图1B为治疗计划和样本采集时间点。此图表展示了患者接受的治疗方案的时间[0131]图2A为IMC和分析工作流程的示意图，此面板说明了我们研究中的实验设置和后个方块的颜色代表相应标记在细胞类型中的平均表一一显著性用方块大小表示为较大的方块表示统计显著的变化（p值<0.05较小的方块表示前2_3治疗后良好与不良反应组的比较（治疗后0_1vs.治疗后2_3良好反应组从治疗包括在良好反应组中CD8+T/B细胞的增加，强调了它们在调节积极治疗结果中的潜在作应细胞类型的相对频率，t检验比较展示了良好和不良反应组间TLS内免疫细胞组成的差代表特定比较组内特定细胞类型中某一标记的平均表达水平倍数变化，X轴代表log2倍数[0143]图6为环境组成的统计评估，t检验比较展示了治疗后良好和不良反应组间TLS周[0150]图13为免疫区域中的相互作用模式，此图显示了治疗后免疫区域内T细胞与其他内治疗后T细胞与成纤维细胞之间增强的相互作用，突出了上皮和成纤维细胞在这一混合应组中上皮免疫交界区域内上皮细胞与T细胞之间的相互作用增加，进一步强调了T细胞[0154]图17为SVM分析的特征选择过程，此面板概述了从最初的8000多个特征中选择和[0156]图19为不同模型中特征数量与AUC之间的关系，此折线图展示了预测模型中使用种比较有助于理解TME在治疗响应中的动态变化及其对持续治[0162]图24B为图24A中展示的十个细胞簇的前三个簇特异性特征基因，展示了图24A中[0163]图24C为主要群体在正常组和肿瘤组之间的分布模式，展示了正常组和肿瘤组之[0164]图24D为UMAP图中识别出的六个巨噬细胞簇，展示了UMAP图中识别出的六个巨噬[0166]图24F为巨噬细胞亚群在正常组和肿瘤组之间的分布模式，展示了正常组和肿瘤以包括多个子步骤或者多个阶段，这些子步骤或者阶段并不必然是在同一时刻执行完成，其他步骤的子步骤或者阶段的一部分轮流或者交替或者同[0185]本申请中的预测因子包括但不限于样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量[0186]本申请中的预测因子包括但不限于样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平和样本中C1QC+巨噬细胞的免疫检[0188]在一些实施方式中，所述试剂1为检测所述耗竭标志物含量或其表达水平的特异IDO1+巨噬细胞的IDO1含量或其表达水平的特异性引物、特异性探针和抗体中的一种或多本中C1QC+巨噬细胞的免疫检查点分子表达水平的试[0191]在一些实施方式中，所述试剂1为检测所述耗竭标志物含量或其表达水平的特异本申请中的抗体是指与本申请所述TNFR1蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常[0202]在一些实施方式中，所述炎症性巨噬细胞选自上皮和成纤维交界区C1QC+的巨噬[0203]在一些实施方式中，检测样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达[0205]在一些实施方式中，所述预测因子的样本来源为食管鳞状细胞癌患者的肿瘤组的试剂盒，其包含用于检测样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平的的试剂盒，其包含用于检测样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平的试剂1和样本中C1QC+巨噬细胞的免疫检查点分子含量[0218]本申请中所述检测预测因子的试剂可直接或者间接用于预测和/或诊断分析食管[0219]在本申请的一些实施方式中，提供一种食管鳞状细胞癌患者的干预效果的预测[0220]在本申请的一些实施方式中，提供一种食管鳞状细胞癌患者的干预效果的预测[0228]在本申请的一些实施方式中还提供预测食管鳞状细胞癌干预效果的模型的构建[0229]获取样本中预测因子的检测数据；所述预测因子至少包括样本中功能性CD8T细食管鳞状细胞癌患者等术语的定义如本申请中的[0233]获取样本中预测因子的检测数据；所述预测因子至少包括样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或其表达水平和C1QC+巨噬细胞的免疫食管鳞状细胞癌患者等术语的定义如本申请中的[0236]在一些实施方式中，所述检测数据包括功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或[0237]在一些实施方式中，所述检测数据包括功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含量或[0238]在一些实施方式中，通过检测所述耗竭标志物含量或其表达水平的特异性引物、特异性探针和抗体中的一种或多种获得所述耗竭标志物的含性探针和抗体中的一种或多种获得所述炎症性巨[0240]在一些实施方式中，所述获取功能性CD8T细胞的耗竭标志物的检测数据于干预[0242]在一些实施方式中，所述构建方法还包括获取干预后的CD8+T细胞和B细胞的频[0248]数据处理模块，用于将接收或输入的样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含[0251]数据处理模块，用于将接收或输入的样本中功能性CD8T细胞的耗竭标志物的含以通过计算机程序来指令相关的硬件来完成，计算机程序可存储于一非易失性计算机可读申请所提供的各实施例中所使用的对存储器、数据库或其它介质的任何引用，均可包括非易失性和易失性存储器中的至少一种。非易失性存储器可包括只读存储器（Read_Only库和非关系型数据库中至少一种。非关系型数据库可包括基于区块链的分布式数据库等，[0260]在本申请的一些实施方式中，还提供一种分析食管鳞状细胞癌的肿瘤微环境的大小定义并识别相邻细胞，根据一定数量相邻的B细胞构成的空间结构单元定义并识别三级淋巴结构，根据所述三级淋巴结构边界外围一定距离的区域定义并识别其对应的邻[0266]确定所述肿瘤微环境中的细胞_细胞间空间互作：基于对细胞类型的定义及其空基本组织结构蛋白。在一些实施方式中，所述源自上皮细胞的基本组织结构蛋白选自由Pan_cytokeratin和E_cad基本组织结构蛋白。在一些实施方式中，源自淋系细胞的基本组织结构蛋白选自由CD45、基本组织结构蛋白。在一些实施方式中，源自髓系细胞的基本组织结构蛋白选自由CD45，[0274]本申请中，源自肿瘤的功能相关蛋白可为本领域常规的源自肿瘤的功能相关蛋[0277]利用预先训练好的TissueNet模型，通过细胞核和细胞膜特异性抗体的扫描图片使用Matlab中的imadjust函数对原始信号强度进行增强，使输出信号更好地在0–255的范[0280]在一些实施方式中，所述细胞聚类采用了层次聚类的方式以减少混杂群的存cytokeratin和αSMA构成的群组中的一种或cytokeratin或E_cadherin阳性细胞成纤维区域细胞类型包含所有类型的纤维细胞(αSMA或CollagenI阳性细胞免疫区域细胞类型包含所有的淋系和髓系相关的细胞类型细胞组成的空间结构被定义为相应的组织区域。鉴定出的组织区域边界外围20μm内的区域被定义为该组织区域的邻域。间的互作强度为中心细胞周围最近的10个细胞中另一[0290]在一些实施方式中，利用成像质谱细胞术(IMC)检测分析所述免疫细胞在三级淋[0297]在一些实施方式中，所述方法还包括根据分析结果建立干预期间TME空间组织的CD4+T/B细胞占比。T细胞上耗竭标志物的表达；C1QC+的巨噬细胞中免疫检查点分子的水平[0305]在一些实施方式中，利用成像质谱细胞术(IMC)检测分析所述免疫细胞在三级淋成像质谱细胞术的检测分析结果判断所述纤维化区域中的细胞因子是否为预测食管鳞状[0309]在一些实施方式中，所述方法还包括根据分析结果建立干预期间肿瘤微环境[0318]当为药物组合物时，所述药物组合物选择性地可以包含药学上可接受的载体和/下两次浸入二甲苯，每次10分钟，以完全脱蜡。通过依次将切片浸入不同浓度的乙醇溶液评估2个ROIs。范围。每个通道的归一化基于最大最小值进行。为了校正批次效应，我们使用了R包中的[0335]使用imcRtools包中的patchDetection来检测局部B细胞聚集形成的组织结构。比随机数据更频繁地表现出重要性。此过程重复10,000次以生成特征重要性的二项[0345]为了准备数据进行分析，使用“NormalizeData”函数进行归一化，并使用“FindVariableFeatures”函数识别前2000个高变基因。为了消除批次效应，使用选择前20个主成分。[0347]ESCC的RNA_seq数据及相应的临床信息从TCGA数据库下载。为了评估每个样本中的细胞类型特征，使用从scRNA_seq数据推导的簇特异性基因集对TCGA样本进行GSVA分析瘤免疫微环境的差异。为了确定所需的样本量，我们进行了功效分析，确保80%的功效和步研究中观察到的免疫细胞浸润和免疫检查点表达水平的差异确定的。使用GPower软本量20%来考虑潜在的退出和不依从性。此调整旨在保持研究结果在现实条件下的完整性床特征的显著富集。与治疗相关的不良事件（AEs）详见表3。主要的不良事件包括脱发Kaplan_Meier曲线展示了55名患者的无进展生存期（PFS）和总体生存期（OS图1E和图[0424]在ESCC免疫微环境空间和细胞谱分析中，识别了多种细胞成分，包括泛角蛋白+表达提示了它们在免疫调节和炎症中的作用，而LAMP3标志着成熟的DCs，对有效的抗原提呈至关重要。+上皮细胞的水平在良好反应组中较高（治疗前0_1vs.治疗前2_3可能表示具有炎症上皮细胞的患者在接受辅助治疗时预后较好。起到潜在作用。细胞和CXCL13+B细胞仅在良好反应组治疗后增加（治疗后0_1vs.治疗前0_1强调了这后2_3vs.治疗前2_3可能导致免疫抑制。[0438]将分析扩展到TLS周围的环境，并采用了先前发布的方法来定义邻近区域的范围细胞毒性T细胞对治疗结果有利。与不良反应组治疗后相比（治疗后2_3在对治疗反应良符合既定的免疫机制，并支持这种治疗策略在增强针对肿瘤的先天免疫反应中的有效性差异。然而在不良反应组中观察到从治疗前到治疗后的Tregs显著增加（治疗前2_3到治疗调节Tregs动态以提高治疗结果的策略。[0440]总之，TLS及其周围环境的差异性动态改变，特别是关于免疫细胞群体和功能标[0448]对TME不同区域及其周围环境的细胞组分及功能相关标志物表达水平的分析，强[0449]实施例5：免疫区域和上皮_免疫交界区域中T细胞浸润和相互作用对良好临床反交界面的CD45RO+CD8+T细胞中的PD_1表达，以及上皮区域和免疫_上皮交界区域的CD4+治疗前2_3强调了T和B细胞中PD_1表达在上皮_免疫交界面作为良好治疗反应的关键决型、神经网络和收缩判别分析。每种算法在不同模型中均表现出高于95%的曲线下面积[0459]为了进一步阐明S100A9+巨噬细胞的作用，并将观察结果扩展到更大的ESCC患者七个手术切除的ESCC肿瘤和相应的正常组织中成功分离的113,240个高质量细胞，并鉴定[0461]此外，利用单细胞数据集计算S100A9+巨噬细胞特异性高表达的前20个基因作为GSVA得分进行的生存分析显示S100A9+巨噬细胞含量与患者生存结果显著负相关。这一分[0464]这项发明展示了在ESCC中结合PD_1阻断剂、纳米白蛋白结合紫杉醇和S_1的新辅助化学免疫治疗方案的显著疗效，高比例的患者实现了病理缓解（MPR）和完全病理缓解结果的关键预测因子包括治疗前CD45RO+CD8+T细胞上PD_1的表达、CD4+T/B细胞PD_1的并有效定制个性化治疗策略中的重要性。[0465]从本研究中获得的空间蛋白质组学数据为理解ESCC临床治疗效果的决定因素提研究首次发现了在TLS内胶原I+的成纤维细胞对肿瘤治疗响应的负面影响。巨噬细胞在免反应组中αSMA+肌成纤维细胞在治疗后频率增加，提示这些细胞可能在调节免疫治疗响应[0468]总之，本研究不仅证明了结合PD_1抑制剂和化疗的新辅助治