SNT 1171.1-2003 山羊关节炎-脑炎抗体检测方法 酶联免疫吸附试验

of of 1171. 1. 4. 4(诊断试验和疫苗标准手册录标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、国家质量监督检验检疫总局标准法规研究中心。本标准主要起草人:杨宝华、崔路、曾宪生、张艳。本标准是首次发布的检验检疫行业标准。 量检测山羊血清中抗山羊关节炎一脑炎病毒抗体的方法。本标准适用于山羊关节炎一脑炎的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测。2试验原理酶联免疫吸附试验(基本原理是将酶分子与抗体或抗体共价结合，此种结合不改变抗体的免疫反应活性和酶的生化活性，酶标记抗体可与吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，随后加人的底物可在酶分子的作用下呈现颜色反应，因而可借颜色反应来判定有无相应的免疫反应，颜色反应的深浅与样品中相应抗体或抗原的量呈正比，通过酶标仪可检测颜色反应的光密度值。本标准的反应原理就是将着加人按一定比例稀释的待检血清，待反应一定时间后，加人酶标记的抗山羊免疫球蛋白抗体，反应完成后，加人底物显色并检测反应结果。标仪、倒置显微镜、超速离心机、高速离心机、细胞培养瓶、多孔道微量加样器、96孑2. 1 氯化钠， 洗涤液含0. 05 % 00 g,氯化钾。g,磷酸氢二钠1. 15 g,磷酸二氢钾。20 g，水溶至1 000 4高盐稀释液含0. 05 0 a 0%小牛血清的0. 5 氯化钠溶液。准抗原、阳性血清、阴性血清由指定单位提供。抗山羊验程序4. 1 2)稀释的50 I口后置40C 48 h，用洗涤液洗板二次，甩干后封口于一20保存备用(用前洗板四次)。 个血清样品加二孔，每板设个阴性对照和四个弱阳性对照，封口后于湿盒中37反应2 干板内液体，洗板六次，甩干后每孔加人50 口后置37反应2卜。续洗板10次，甩干后每孔加入100 。. 1 2柠檬酸盐一磷酸盐缓冲液配制的浓度为。5 mg/含。1%过氧化氢)，轻拍摇匀后置暗处反应10 孔加人50 2 硫酸终止反应。即D),弱阳性对照2时进行判断，15时，判为阴性;为阳性;1520之间时判为可疑，所有可疑或只有一孔呈阳性反应的样品，都必须进行重复试验，若仍出现可疑结果则判其为阳性。 1171. 1料性附录)胰蛋白酶(乙二胺四乙酸二钠(海试剂一厂产品);二甲基亚枫(为应用液另加25 He 1 丙酮酸钠，2 0 二硫基乙醇, 10 X 10 青霉素，100 链霉素和10%小牛血清,2原代山羊滑膜细胞的制备A. 2. 1放血处死初生山羊，无菌条件下分离膝关节滑膜组织，用无钙、镁磷酸盐缓冲液洗涤山羊滑膜组织三次，剪成约1 块，放人100 . 2. 2加5倍于滑膜组织的含10%胶原酶，37%二氧化碳培养箱内消化. 2. 3将未粘附细胞移人离心管，300 上清液，蛋白酶溶液，在370C,5%二氧化碳培养箱作用20 4层纱布过滤，将滤液离心(300 g,10 A. 2. 5用整细胞浓度至0. 5 X 10 370C,5%二氧化碳培养箱培养24 去未贴壁细胞，置换时已贴壁细胞为原代滑膜细胞。A. 2. 6继续培养，直至细胞长成连续单层细胞。A. 3原代山羊滑膜细胞的继代和扩大培养A. 3. 1将已长成连续单层的原代山羊滑膜细胞用无钙、镁磷酸盐缓冲液洗二次后，蛋白酶一。. 02 0 a 细胞固缩时倾去消化液，加人含10写小牛血清的00 细胞再次用细胞浓度至。5 X 10 瓶培养。依此可连续继代扩大培养。A. 4继代山羊滑膜细胞的保存A. 4. 1取已长成单层的继代山羊滑膜细胞，倾去培养液，用无钙、镁、磷酸盐缓冲液洗二遍，按A. 3. 1的描述收集细胞，将离心后的细胞沉淀用含20%小牛血清、10%二甲基亚枫的整细胞浓度至5 X 10 l . 4. 2写好标贴分装好的细胞冻存管置一80冰箱,24 氮保存。5. 1取一196液氮保存的继代山羊滑膜细胞冻存管立即投人370C 浴中，冻存液溶解后加人10倍体积的. 5. 2以300 上清，细胞沉淀用整细胞浓度至1瓶后于370C,5%二氧化碳培养箱培养至连续单层细胞，继续继代和扩大培养。A. 6制备期限继代山羊滑膜细胞可连续继代20代以上，一般在每年的产羔季节制备继代山羊滑膜细胞可满足一年的需求。 1171. 1料性附录)1病毒增殖将现合胞体后，每周收集培养液直至细胞单层完全破坏，收集的培养液置4保存备用。B. 2病毒纯化和2. 1将收集的培养液以10 000 以10 000 心16 . 2. 3将病毒沉淀以原培养液1/1 000体积的将此悬浮液在600 着将上清液加到质量浓度)的蔗糖垫上，在4以42 000 h,将病毒沉淀再悬浮于原培养液1/1 000体积的. 2. 4用等体积的乙醚处理弃上层乙醚液，待乙醚挥发完全后，剩余的悬浮液即为于本试验，分装保存于一70备用。3. 1用2)倍比稀释抗原(32 1L/16 IL/8 pL/4 pL/2 pL/pL/取96孔聚乙烯板，每个稀释度加一列，每孔加50 湿盒内37包被24 h,B. 3. 2用含。. 05 % 干后加500高盐稀释液稀释的阳性血清和阴性血清各三排，最后两排各孔加5