优质课DNA的粗提取与鉴定PPT课件

1、-,1,一、基础知识,（一）提取DNA的方法,1.提取生物大分子的基本思路,选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子,2.提取DNA的基本思路（DNA的粗提取）,利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。,-,2,DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀；,或者让其他成分溶解，DNA析出,3.DNA等大分子的理化性质,DNA不溶于酒精溶液,DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,-,3,4、DNA的溶解性DNA和蛋白质等其他成分在

2、不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反,根据DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线图，思考在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在NaCl溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为2molL时，DNA的溶解度最大，浓度为014molL时，DNA的溶解度最低。利用

3、这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,-,4,DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将DNA与蛋白质进一步分离。,DNA不溶于酒精溶液,DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶水解蛋白质，对DNA没有影响,高温大多数蛋白质不能忍受6080而DNA在80以上才会变性,洗涤剂瓦解细胞膜，但对DNA没有影响,-,5,-,6,试剂：,（二）DNA的鉴定,条件：,二苯胺,沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色,沸水浴,现象：,-,7,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）除去滤液中的杂质(纯化),（四）DNA的析出与鉴定,二、实验设计,-,8,（一）实验材

4、料的选取,从下列材料中选取23种,原则：,菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞；在液体培养基中培养的大肠杆菌,凡是含有DNA的生物材料都可以考虑但是，选用DNA含量相对较高的组织，成功的可能性更大,材料：新鲜的鸡血（注意要加入柠檬酸钠，防止血液凝固）,思考题：能否选用牛、羊、猪红细胞血做实验材料？为什么？,不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核,-,9,动物细胞的破碎较易，以鸡血为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞,答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液，水分可以大

5、量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。,讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,-,10,2、植物细胞植物细胞需要先用一定的洗涤剂溶解细胞膜,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,-,11,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少

6、，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,-,12,思考：加入蒸馏水的目的是什么？,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,思考题：搅拌的目的（注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能过快过猛，防止打碎DNA）,加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA,思考：这个步骤过滤获得什么？,获得含核物质的滤液（获取含DNA的滤液）（注意：此时释放出来的大量DNA和RNA往往与蛋白质结合在一起，应用34层纱布进行过滤，除去一些颗粒较大的杂质）,思考：滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质（为了纯化提取的DNA需要将滤液作

7、进一步处理）,-,13,1.DNA的溶解性,（三）除去滤液中的杂质,方案一、在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液浓度为2mol/L，过滤除去不溶的杂质，再加入蒸馏水，调节NaCl溶液浓度为0.14mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用2mol/L的NaCl溶液溶解DNA。,思考：加入2mol/L的NaCl溶液，搅拌1min，注意应沿一个方向，目的是？,目的是使DNA充分溶解,思考：过滤溶解有DNA的2mol/L的NaCl溶液，获得什么？,含DNA的滤液,思考：这一步过滤的目的是？,含DNA的滤液，除去不溶的杂质,-,14,DNA的析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验

8、成败的关键。,加蒸馏水降低NaCl溶液浓度，使DNA析出。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕。同时应注意控制加水量，使NaCl溶液的始终浓度为0.10.2mol/L。加水太多、溶液过稀，会使DNA分子又重新溶解。,注意：在析出DNA的黏稠物时，要缓缓加蒸馏水，直至溶液中黏稠物不再增加,-,15,思考：加蒸馏水的目的是？,调节NaCl溶液物质的量为接近014mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出,思考：这一步搅拌的目的是？（轻轻地沿一个方向不停地均与搅拌）,稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物,思考：这一步过滤含DNA黏稠物的014mo

9、l/L的NaCl溶液，获得什么？,获得DNA黏稠物（纱布上的DNA黏稠物）,思考：过滤的目的？,获得DNA黏稠物。除去溶液中的杂质,-,16,为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,1、用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；2、用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,-,17,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二：利用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的DNA与蛋白质分开；方案三：利用DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与DNA分离,-,18,（四）DNA的析出与鉴定

10、,与滤液体积相等的冷却的酒精溶液(体积分数95)，静置23min，溶液中会出现白色丝状物粗提取DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,思考：搅拌的目的(玻璃棒朝一个方向缓慢、均匀地搅拌),卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA,-,19,-,20,2.DNA的鉴定,向两支试管中分别加入2mol/LNaCl溶液5ml其中一支试管中加入DNA丝状物，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解向两支试管中各加入二苯胺试剂4ml混匀后，置于沸水浴中加热5min待试管冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象：,溶解丝状物的溶液变为蓝色,-,21,1、以血液为实验材料时，每

11、100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。,二苯胺试剂的配制称取1.5g二苯胺，溶于100ml冰醋酸中，再加入1.5ml浓硫酸，用棕色瓶保存。临用前，在10ml的上述溶液中再加入0.1ml体积分数为0.2%的乙醛溶液。,三、操作提示,-,22,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可

12、能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备,四、课题成果评价,（一）是否提取出了DNA,（二）分析DNA中的杂质,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质,-,23,过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液获得含核物质的滤液过滤含粘稠物的0.14mol/LNaCl溶液获取纱布上的DNA粘稠物过滤溶解有DNA的2mol/LNaCl溶液得到含DNA的滤液,本实验中有三次过滤,获得什么？,-,24,第一次搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA第二次搅拌加2mol/LNaCl溶液的滤液目的是使DNA充分溶解在2mol/LNaCl溶液

13、中第三次搅拌加蒸馏水至0.14mol/LNaCl溶液稀释NaCl溶液,析出DNA黏稠物第四次搅拌放入2mol/LNaCl溶液中纱布上的粘稠物使DNA黏稠物充分溶解在2mol/LNaCl溶液中第五次搅拌体积分数为95%的酒精,实验中有五次用玻璃棒搅拌?分别有什么作用?,卷起DNA丝状物，获取含杂质较少的DNA,-,25,本实验两次用蒸馏水,第一次：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA第二次：调节NaCl溶液物质的量为014mol/L，使DNA黏稠物最大限度的析出,本实验两次析出DNA,第一次：用0.14molL的NaCI溶液析出DNA，过滤除去溶液中的杂质,第二次：用冷却的95的酒精，获得含杂质较少的DNA丝状物（利用DNA容易酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精）,-,26,实验成功的关键及注意事项,1.破碎细胞，释放DNA的过程中，若是血细胞，加水后必须充分搅拌，不应少于5min；若是菜花，则应与研磨液混合，研磨时间不少于10min,2.用冷酒精浓缩和沉淀DNA时，所用的95%的酒精必须经过预冷后才能使用,3.在用玻璃棒搅拌时，玻璃棒不能直接插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子,4.由于玻璃表面带电荷，DNA中的磷酸基