生物检定法课件

1、生物检定法,( Bioassay; Biological standardization),主 要 内 容,第一节 概 述,第二节 生物检定质反应的直接测定法,第四节 生物检定法的应用,第三节 生物检定量反应的平行线测定法,第一节 概 述,五.生物检定的常用方法,二.生物检定的应用范围,三.标准品,四.生物检定中的基本概念,一.生物检定法简介,六.生物检定的步骤,七.生物统计知识,一 生物检定法简介 1.什么是生物检定法？,待检药物,被测物的相对效力 （效价或毒性） 有效性 安全性,生物体,标准品,活性反应,动物 组织 细胞 微生物,相对快速、重复性 好、不能反映药品 的生物特异性和有 效性,

2、反映药品的生物特异性和有效性 繁琐、误差大,2. 生物检定采用的实验方法,体外测定 (in vitro) 离体器官、组织,微生物, 酶和细胞,类 别,3. 生物检定法特点,以药理学反应为基础 (定量药理学剂量和反应的函数关系) 以标准品对比校验为手段 （在产生特定反应情况下，以供试品与标准品剂量比值推算供试品效价） 以生物统计学方法为结果判断的依据,真正的活性测定，与理化分析、蛋白结合试验不同； 但生物差异性大（实验误差大）、专业性强、实验周期长，人力、物力消耗大，计算较繁。,控制生物差异性的方法与措施:,生物来源、饲养或培养条件必须均一。 采用特定的实验设计,对影响实验误差的条件和 因子进行

3、限制,减少实验误差。 用生物统计方法提高实验的可靠性。,4. 生物检定的必要性,理化方法不能反应其活性。,为理化分析的补充,多组分生物药物无适当理化方法进行检定；,多组分、组分不明确、组成不定、结构不清楚的药物 抗生素、细胞因子类、血液制品、疫苗、酶(含异构体)、多肽激素(含异构体)。,肝素,天青A显色,比色法测定 ,（但变性的肝素同时显色， 不能反应肝素活性）,所以: 肝素,抗凝血活性 ,应用 范围,3,4,2,微量生理活性 物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,多组分生化药物制剂、激素类药物、生物制品: 由结构类似、而生物活性不同、比例不定的多种成份组成，

4、或其组分不明确、结构复杂，难用理化方法反映其生物活性； 虽可用理化方法测定含量，但含量不能完全反映效价 （生物检定是反映产品质量的重要指标，具有专属性。 当前英国、美国及中国药典都有收载）,药物效价测定,生化药物 肝素、胰岛素、缩宫素、绒促性素、硫酸鱼精蛋白、精蛋白锌胰岛素、卵泡刺激素、黄体生成素、降钙素、生长激素、升压素等21个品种（约占我国生化药的10% ） 抗生素 生物制品 菌苗、疫苗、抗毒素、类毒素等,药典生物药物效价测定品种:,应用 范围,3,4,2,微量生理活性 物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,无菌、微生物限度、热原、细菌内毒素、 异常毒性、

5、降压物质、过敏等 药典几百种,有害杂质限度检查,应用 范围,3,4,2,微量生理活性 物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,一些神经介质，激素等微量生理活性物质，由于其很 强的生理活性，在体内的浓度很低，加上体液中各种物 质的干扰，很难用理化方法测定。 而不少活性物质的生物测定法由于灵敏度高、专一性 强，对供试品稍作处理即可直接测定。 如乙酰胆碱，5-羟色胺等活性物质的测定。,微量生理活性物质测定,应用 范围,3,4,2,微量生理活性 物质测定,某些有害杂质限度检查,中药质量控制,二 生物检定法的应用范围,中药成份复杂，大部分中药的有效成份尚未 搞清，难以用理

6、化方法加以控制，但可用一 些以其疗效为基础的生物测定方法来控制其 质量。,中药质量控制,三 标准品与供试品及其表示,标准品（S）：系指用于生物检定中效价测定的标准物质，以效价单位(U)表示。 PS表示S的效价 国家标准品：系指用国际标准品标定的用于定量测定某一制品效价或毒性的标准物质，其生物活性以国际单位（IU）或以单位（U）表示。,供试品（T） 供试品(T)是供检定其效价的样品,它的活性成分应与标准品基本相同。,AT是T的标示量或估计效价 PT是经检定的T的效价, 称“测得效价”,效价是表达药物效力强弱或活性物质含量的一种公 认的剂量单位。 效价单位（U）是衡量生物药物有效成分效力的具体尺度

7、。 效价:用每毫升或每毫克中含有某种生物药物的效价单位数表示药物效力或浓度单位 U/mg，U/mL 例如: 青霉素钠的效价为 1670 U/mg 庆大霉素的效价为 590 U/mg 洋地黄的效价为 10 U/mL,效价单位(效应浓度单位),（一）生物反应（生物检定的基础） （二）剂量与反应的关系 （三）等反应对比检定,四.效价检定中的基本概念,（一）生物反应（生物检定的基础）,（二） 剂量与反应的关系,生物反应类型 质反应：给药后,观察某一反应的某一程度出现与否。如是否死亡、是否惊厥，是质的变化，称质反应。 量反应：药物对生物体所引起的反应随着药物剂量的增加产生的量变可以测量者,称量反应。 如

8、血压、血凝时间、血糖等。,剂量与反应的关系,某降压药： 剂量 降压作用 1g 15mmHg 2g 25mmHg 3g 30mmHg,剂量与反应间一般呈曲线关系,剂量与反应关系的直线化,剂量与反应间一般呈曲线关系,将剂量取对数(lgd)后可与反应(y)成直线关系,生物检定中的剂量常用对数表示,将药物的供试品（T）和已知效价的标准品（S）对生物体进行同时对比，以对T的效价（或毒力）进行检定的方法。属于对比检定。,（三）等反应对比检定* （相对效力的计算）,S dS （标准品剂量）； PS （标准品效价） T dT （供试品剂量）； PT （供试品效价）,对于量反应： S和T各自的对数剂量和反应应呈

9、直线关系 S和T的两条直线应平行,等反应对比检定原理,lgdS= XS lgdT= XT M=lgdS-lgdT= XS-XT,S与T等反应时所对应剂量分别为：,等反应时: S和T中所含效价应相等，即： dTPT=dSPS （S和T中所含效价单位数） 令： R=PT/PS=dS/dT （1）, PT= RPS （2） 求出R就可以求出PT,（R为等反应效价的比值）,（1）式两边取对数，lgR=lgPT/PS=lg(dS/dT)=lgdS-lgdT 令lgR=M, lgd=X, 则 对数效价比值： lgR=M=lgdS-lgdT= XS-XT R=lg-1M= lg-1 (XS-XT) PT=R

10、PS=lg-1 MPS 实际工作中S的剂量常按已知效价计算，而T的剂量按标示效价或估计效价（AT）来安排: PT= RAT,R=PT/PS=dS/dT （1）,五 生物检定的常用方法,(一) 质反应的直接测定 (二) 量反应平行线测定法,六 生物检定的步骤,实验设计的选择 反应指标的测定 实验可靠性检验(方差分析) 相对效力的计算及可信限的估计,学习要求,特定的实验设计- 常用对称定型实验设计看懂 生物统计方法- 常用定型公式或简算法计算弄懂基本道理;会套用,七.生物统计知识 （实验设计及方差分析）,（四）实验可靠性检验（方差分析),（一）实验设计的目的,（二）试验设计重要三原則,（三）生物检

11、定常用实验设计,一.实验设计的目的 最少的代价获得最多的信息 可有效排除混杂变异对结果的影响 便于采用简化计算 (采用定型对称设计有利于有效性检验的简化) 采用特殊实验设计 (提高精度和灵敏度),标准曲线法与量反应平行线4.4法测定 LMWH产品抗FXa效价比较,标准曲线法结果误差大,重现性差,波动大,缺乏可比性；当采用量反应平行线原理的44实验设计,结合生物统计, 其结果较平稳,误差小,重现性好。,二.试验设计重要三原則,重复 随机 对照,如：试验某种降压药物的降压作用： 将20只雄性大鼠随机分成两组，每组10只，一组作为空白对照，一组给予待测药物。,完全随机化设计 随机区组设计 交叉实验设

12、计,三.生物检定常用实验设计,1 完全随机化设计,动物号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 随机号 1 2 0 3 8 7 4 5 9 6 组 别 甲 乙 乙 甲 乙 甲 乙 甲 甲 乙,将10个观察对象随机分为两组：,例：洋地黄效价测定鸽最小致死量(MLD)法,单号为甲组，双号为乙组,2 随机区组设计,将分成8各区组（如来自8个窝的动物）的32个受试者随机分配到A,B,C,D四个处理组各区组中的受试者被随机分配接受的不同处理,例：催产素生物检定法大鼠子宫法,3.交叉实验设计,S为标准品组，T为供试品组,平衡实验次序的影响。把不同因素不同水平均摊于受试对象，去除试验时间次序和试验次序的

13、影响,例:小鼠血糖法测定胰岛素效价,处理在同一受试对象上重复观察，由于处理是在同体上比较，从而避免了个体差异。,四 方差分析(F检验),1. 方差分析的概念 用于推断多个总体均数有无差异(差异显著性)的检验方法,如： 观察四种降压药对大鼠的降压效果 或观察四个剂量的降压药对大鼠的降压效果,2.方差S2 ： 是测量值在其总体均值周围分布状况的一种量度， 方差表征随机变量分布的离散程度。,方差S2 = =,f =n-1,自由度,离均差,(yi- )2,f,SS,f,方差S2 = =,f =n-1,f,SS,f,方差S2 = =,差方和SS,f =n-1,f,SS,f,方差S2 = =,f =n-1

14、,f,SS,f,方差S2 = =,f =n-1,f,SS,f,方差S2 = =,f =n-1,f,SS,f,组间变异（处理效应）用组间方差表示； 组内变异（随机误差）用组内方差表示。,3. 方差分析原理,S2总= S2处理 + S2误差,s2总= s2处理 + s2误差,4 方差和F值计算方法,SS总= SS处理 + SS误差,f总= f处理 + f误差,SS误差=SS总SS处理,f误差= f总 f处理,s2总= SS总/f总； s2处理 =SS处理/ f处理,s2误差=SS误差/ f误差,=,方差分析（F检验）:,以处理组方差(S2)与误差项方差（S2（误差）的比值（称F值）来确定处理效应差

15、异的显著性程度。,查F值表， 当F计算值大于P0.05或P0.01的查表值时，则P 0.05或P0.01，即为在此概率水平下该项变异有显著意义。,5.方差分析(F检验)的步骤,建立检验假设：无效假设把处理间的方差12与误差的方差假设相等即：H0：12=22 ；备择假设 HA：1222 计算各处理组的方差及组内的方差，求出相应的F值。 计算所得的F值与F表中按一定自由度查得的F0.05或F0.01进行比较 若处理组FF0.05（F0.01）则拒绝H0，接受HA，认为该处理所引起的差异有显著（极显著）意义。 若处理组F F0.05则接受H0，认为该处理所引起的差异无显著意义。,第二节 质反应的直接

16、测定,一. 测定程序 将实验对象随机分成两组，S组与T组，分别测定两组 的MED（最小效量） y值 计算出M、R和PT 估计实验误差（用可信限（FL）表示）,以产生质反应的最低效量(MED)为反应指标（y）,按公式计算出M，再求算R和PT： R=lg-1M PT = RAT,二.M和PT的计算,R= PT/PS=dS/dT,误差项方差S2的计算,三.实验误差的估计（用可信限（FL）表示）,步骤：,标准误SM的计算,可信限（FL）的计算,1.误差项方差S2的计算,nS、nT为标准品和供试品的反应个数,2.标准误SM的计算,是指平均数的标准差, 即各均数之间差异的大小,用SM表示,SM越小差异也越

17、小。,S 2为误差项方差 nS、nT分别为标准品和供试品的反应个数 用SM对总体均数进行评估，计算可信限。,标志检定(R和PT)结果的精确度 R的FL=lg-1(MtSM) PT的FL=ATlg-1(MtSM) t(f,0.05)：根据f和概率水平查表获得,3 可信限（FL）的计算,R或PT的FL%= 100%,除药典另有规定外，可信限率不得大于5%。,4. 示例: 质反应直接测定法 洋地黄效价的测定鸽最小致死量（MLD）法,本法系比较洋地黄标准品(S)与供试品(T)对鸽的最小致死 量(MLD，U/kg)，以测定供试品的效价。,实验方法：,标准品稀释液的配制,供试品溶液和稀释液的配制,检定法,

18、按直接测定法计算效价(PT)及实验误差FL() 本法的可信限率FL()不得大于15。,鸽 (250400g),标准品组 (6只),供试品组 (6只),注射S至死亡,MLDS (UKg),MLDT (UKg),注射T至死亡,测定结果,(X)2 38.019 40.755 X2 6.342 6.811,效价的计算,M = = 1.028 - 1.064= -0.036 R=lg-1M = antilg M = antilg(- 0.036) =0.9204 PT=RAT=0.920410 U/g =0.9204 U/g,已知： XS= 1.028； XT= 1.064；AT=10 U/g,误差项S

19、2及可信限计算,已知： XS2 = 6.342 XT2= 6.811 (XS)2= 38.019 (XT)2 = 40.755 nS= nT=6,0.02812,R的 FL= lg-1(MtSM) 查t值表 t(10)0.05=2.23（P=0.95） lg-1 (M + tSM)是R的高限; lg-1 (M - tSM)是R的低限 PT的FL=AT lg-1 (MtSM) ATlg-1 (MtSM)是PT 的高限； ATlg-1 (MtSM)是PT的低限 PT的FL = 7.9710.6(U/g),PT的 FL%=,10.6-7.97,29.20,100%=14.3%,结果PT的 FL%15

20、，实验结果可靠。,直接测定法的优点： 可使用较少量的动物，直接测得S和T的等反应剂量 直接测定法常用的实验设计： 随机设计 配对交叉设计,小 结,对于量反应： S和T各自的对数剂量和反应应呈直线关系 S和T的两条直线应平行,一.量反应的平行线关系,第三节 量反应平行线测定法, R=dS/dT；lgR=lgdS-lgdT=XS-XT=M R=lg-1M=lg-1（XS-XT） 当供试品按标示量或估计效价进行试验时: PT=ATR 或 PT=ATlg-1M,量反应的测定方法:常用(k.k)法，如(2.2法)和（3.3法）。 或称4点法（S和T各用2个剂量组）和6点法（S和T各用3个剂量组）。,二.

21、 测定原理,等反应时(yS=yT) : dTPT=dSPS 则： R=PT/PS=dS/dT 令： M = XS-XT,三. 量反应平行线法常用的实验设计,随机设计 随机区组设计 交叉设计,四.测定步骤,按定型实验设计进行指标测定； 将测得反应值(y)按剂量分组列成方阵表; 方差计算和可靠性检验（采用定型公式的简算法）； 进行效价及可信限计算（采用定型公式的简算法）。,(一) 药典对各种(k.k)法的要求,S和T相邻高低剂量组的比值（r）要相等，一 般r用（10.8)-（.5），lgr=I。 各剂量组的反应个数(m)应相等。 k为S和T的剂量组数之和（k+k）。,（二）将反应值(y)按S和T的

22、剂量分组列成方阵表,k为S和T的剂量组数和，m为各剂量组内y的个数,1.可靠性检验的项目：,剂间差别 (即期望显著P0.05) (检测不同剂量所致反应是否有明显的差别)。 试品间的差别（期望不显著P0.05） （标准品与供试品间的差异） 回归差别 (期望非常显著P0.01) （检测剂量与反应是否成直线） 偏离平行差别 (期望不显著P 0.05) (检测标准品与供试品间直线是否平行),（三）量反应平行线测定可靠性检测,以剂间（列）、试品间、回归、偏离平行的方差(S2) 与误差项方差（S2（误差）的比值（称F值）来确定各自 差异的显著性程度和实验结果的可靠性。,2.可靠性检验的原理,查F值表， 当

23、F计算值大于P0.05或P0.01的查表值时， 则P 0.05或P0.01，即为在此概率水平下该项变异有显 著意义。,（1）各检验项方差（S2）的计算,S2（总）= S2（剂间）+ S2（区组间）+ S2（误差）,剂间方差（S2剂间）可分解为各具一个自由度的方差： 包括试品间、回归、偏离平行的方差,（2）剂间变异的方差分析,(S2剂间=S2试品间+S2回归+S2偏离平行+S2二次曲线 +),各项剂间变异的方差根据正交多项系数进行求算,Ci正交多项系数,各项剂间变异的方差计算：,f =1,四点法：试品间 (Ciy(k)=T1+T2-S1-S2 回归 (Ciy(k)=T2-T1+S2-S1 偏离平

24、行 (Ciy(k)=T2-T1-S2+S1,各项剂间变异的方差计算公式,（3）误差项方差（S2误差）的计算：,差方和（误差）=差方和（总）-差方和（剂间）-差方和（区组间） f （误差）= f （总）- f （剂间）- f （区组间）,f（误差）,S2（误差） =,差方和（误差）,不易直接得出，一般由以下公式推出：,（4）效价测定的可靠性测验结果,剂间变异分解,各种(kk)法都按表计算V、W、D、A、B、g等数值，代 入公式(1)(4), 计算R、SM、PT以及R、PT的FL和FL等。,五.效价(PT)及可信限(FL)计算（简算法）,（V、W、D、A、B、g等值均用S，T，dS，dT值求算）,

25、计算软件：,中国药典生物检定统计程序 BS 2000 ForWin-dows 9X,六.量反应平行线法测定实例 1.缩宫素效价测定,S为缩宫素标准品: dS1:0.0068u dS1:0.009u T为缩宫素注射液 标示量AT: 10u/ml dT1:0.008u dT2:0.0106u r=1:0.75 I=lg r=lg(1/0.75)=0.125 反应(y): 子宫收缩高度(mm),(随机区组设计(2.2) 法), 实验安排, 给药顺序,将标准品和供试品高低2个剂量组S1，S2，T1，T2 分别用ABCD表示，作出5组收缩数据（5个区组）。 给药顺序： ABCD BCDA CDAB DA

26、BC CBDA,随机区组设计(2.2)法，K=4， 每组4个剂量为一个区组，m=5,将反应值(y)按S和T的剂量分组列成方阵表,可靠性检验,总差方和,剂间,区组间,误差项差方和及自由度 计算 剂间变异分析 可靠性检验,=39.52+37.02+60.02+60.02-(964.0)2/(5*4)=3600.20 f=mk-1=54-1=19,=(173.022+301.522+183.522+306.022)/5-(964.0)2/(54) =3163.10 f=k-1=4-1=3,总差方和,剂间,区组间,误差项差方和及自由度,总差方和,剂间 差方和,SS误差= SS总- SS组间- SS区组

27、,=(219.52+188.52+.+184.02+175.02) /4(964.0)2/(54) =285.82 f=m-1=5-1=4,SS (误差) =3600.20 3163.10 285.82=151.28,区组间 差方和,误差项 差方和,f= f总 f组间f区组=19 3 4=12,剂间各项变异包括：(2.2)试品间、回归、偏离平行,剂间各项变异方差计算,各项变异差方和=(Ciy(k) 2/mCi2,Ci为正交多项系数，各变异项的正交多项系数 计算方法见下表,表（2,2）法剂间各项变异差方和计算方法,试品间 (Ciy(k)=T1+T2-S1-S2 回归 (Ciy(k)=T2-T1+

28、S2-S1 偏离平行 (Ciy(k)=T2-T1-S2+S1,缩宫素效价测定(2.2)法可靠性测验结果,结论: 回归非常显著(P0.01), 偏离平行不显著(P0.05), 实验结果 成立。 区组间差异显著(P0.05),分离区组间变异,可以减少实验误差。,效价(PT)及可信限(FL)计算,已知: r =1:0.75, I=0.125, S2=12.61, f=12, t=2.20 AT=10U/ml，m=5 计算: V, W, g, R, PT V= 1/2(T1+T2-S1-S2) =7.5 W= 1/2(T2-T1+S2-S1) =125.5,PT= ATR=100.864=8.64(U

29、/ml),D=dS2/dT2=0.009 /0.0106 A=1 B=1,=0.0083632,2.胰岛素生物检定法,小鼠血糖测定法 双交叉设计量反应平行线法 P113,方法可靠性检验 PT和FL计算,（自学）,3.抗生素微生物检定法,量反应平行线(2,2)或(3,3)法,常用琼脂扩散法-管碟法,4.葡萄糖酸锑钠毒力检查法,产品毒性不稳定，受工艺影响大，须逐批进行毒性检验。,本法系比较葡萄糖酸锑钠标准品（S）与供试品（T）引致小鼠死亡的鼠数，以判定供试品毒力是否符合规定。,以小鼠死亡数为指标,检查法,小鼠40只,标准品组20只,供试品组20只,尾静脉注 0.02ml/ 1g体重,记录小鼠死亡数

30、,结果判断,T(死亡数)S(死亡数) 合格 T(死亡数) S(死亡数) 不合格,5.肝素生物检定法（随机或随机区组设计）,本法系比较肝素标准品(S)与供试品(T)延长新鲜兔血或兔、猪血浆凝结时间的作用,以测定供试品的效价。,（2.2）四点法或（3.3）六点法 家兔全血或血浆法,第四节 生物检定法的应用 一 缩宫素的生物检定实验,（一）概述 来源：缩宫素即催产素由哺乳动物脑垂体后叶分离精制或化学合成的。 化学本质：由8种氨基酸组成的多肽化合物。 物理性质：能溶于水，在弱酸性溶液中稳定，在碱性溶液中易失去活性。,药理作用: 为收缩平滑肌，对子宫平滑肌有选择性兴奋作用，在一定的生理状态下，使子宫产生

31、节律性收缩，并有生乳作用。 检定方法： 各国检定方法不同。 中国药典(2005)采用大鼠离体子宫法，该法系比较垂体 后叶标准品(S)与供试品(T)引起离体大鼠子宫收缩的作用，以 测定供试品的效价。,（二） 实验设计,采用(2.2)法随机区组设计， r= 1：0.7 选择标准品和供试品反应适度的高低两个剂量。标准品 和供试品高低四个剂量为一组，以A、B、C、D表示做 出46组收缩记录，可按以下顺序给药：ABCD、 BCDA、CDAB、DABC、ACBD、CBDA、BDAC、 DACB、ADCB、DCBA。,（三）缩宫素检定法的操作步骤,（一）选择大鼠（动情期） （二）处死大鼠、取子宫 （三）清除

32、结缔组织、固定子宫肌 （四）调节记录装置与测试子宫肌灵敏度 （五）给药测定,（四）计算检定的实验结果,1.将反应值(y)按生物检定统计法格式整理 2.量反应平行线测定(2.2)法随机区组设计的公式(实验 中随给药次数增加而呈明显递增或递减时，用随机区组设计)处理结果。进行可靠性测验，实验结果成立者，再进行以下计算。分别计算M、R、PT、SM、FL、FL。 本法的可信限率(FL)不得大于10。,动物血压器官测量仪,成年雌性大鼠,取选定的大鼠迅速处死,剖腹,取出子宫,在二角子宫相连处之下端剪断,将子宫置于盛有蓄养液的培养皿内,注意：避免因牵拉使子宫肌受损,仔细清除附着的结缔组织和脂肪,穿线,取一条将其下端固定于离体器官恒温水浴装置的浴杯底部，上端用线与记录装置相连，以描记子宫收缩。,子宫,测试子宫肌灵敏度,更换蓄养液,给药