10第五章-植物细胞工程制药二

1、第五章 植物细胞工程制药,1,第五章 植物细胞工程制药,（二）,第五章 植物细胞工程制药,2,本章内容,概述 植物细胞的形态和生理特性 植物细胞培养的基本技术 影响植物次级代谢产物累积的因素 植物细胞培养的生物反应器 进展与展望 药用植物细胞培养实例,第五章 植物细胞工程制药,3,四、影响植物次级代谢产物累积的因素,在植物组织和细胞培养过程中，影响植物次级代谢产物产生和累积的因素主要有： 生物条件：外植体、季节、休眠、分化等； 物理条件：温度、光（光照时间、光强、光质）、通气（O2）、pH和渗透压等； 化学条件：无机盐（N、P、K等）、碳源、植物生长调节剂、维生素、氨基酸、核酸、抗生素、天然物

2、质、前体等； 工业培养条件：培养罐类型、通气、搅拌和培养方法等。,第五章 植物细胞工程制药,4,外植体的选择,不同外植体的悬浮细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间各异。 同一化合物可以在不同外植体的不同生长阶段中累积，有的次级代谢产物累积是在延迟期进行，有的则在加速期累积。 有的累积时间与细胞生长曲线同步，还有的则在稳定期大量累积次级代谢产物。,第五章 植物细胞工程制药,5,第五章 植物细胞工程制药,6,培养条件的影响,营养成分、生物及非生物元素。 酸度、通气以混合程度、与接种有关的因素。 剪切力、搅拌频率、温度和光。,第五章 植物细胞工程制药,7,培养环境的内在因素,接种和诱导 ：外植体

3、的大小直接影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。如长春花培养物中蛇根碱的合成要求其外植体直径在112cm之间，在此条件下才能分泌噻吩类成分。 外植体的前处理也可严重影响次级代谢产物的累积方式。,第五章 植物细胞工程制药,8,培养环境的内在因素,培养基的组成：基本培养基的各种成分是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。 磷:低磷会导致次级代谢产物的累积，缺乏磷会导致生物量的大幅度降低。 氮:有些植物可利用硝酸盐作为第一氮源，而有些则利用铵盐作为第一氮源，有些需要两种氮源，还有某些需要特殊的有机氮源。如天冬氨酸、尿素、酪蛋白水解物或蛋白胨。,第五章 植物细胞工程制药,9,

4、培养环境的内在因素,铜:作为邻及对-二酚可抗坏血酸氧化酶活性基团的作用，是次级代谢产物累计的必要元素，还可作为非生物诱导子。 碳源:自养培养的二氧化碳和异养培养的糖类，性质和数量往往对培养细胞的生物量有很大的影响。 糖类:对次级代谢产物的影响主要取决于所使用的糖类的种类和浓度及细胞次级代谢产物的生物合成过程，还可增强生物碱起始合成酶的活性和增加相关mRNA 的浓度。,第五章 植物细胞工程制药,10,碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响,第五章 植物细胞工程制药,11,培养环境的内在因素,植物生长调节剂：植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。 植物

5、材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。,第五章 植物细胞工程制药,12,培养环境的内在因素,O2 ：培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同。 前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为120160r/min，过快易导致细胞破裂。 后者仅能采用通气方式，一般使用含5%CO2的洁净空气，通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。,第五章 植物细胞工程制药,13,培养环境的内在因素,pH：最有利于培养细胞生长的pH在56之间。 常用的培养基均具有一定的缓冲性质，在培养过程中培养液的pH

6、变化较小。 培养基在细胞生长过程中会变酸或变碱。,第五章 植物细胞工程制药,14,培养环境的内在因素,渗出物（exudates）：在细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物，如某些初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。 次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。,第五章 植物细胞工程制药,15,两步培养法,培养基的组成是细胞生长和次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。 为了得到最佳生长和最佳次级代谢产物，提出了两步法。 第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（growth medium）。 第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养

7、基，称为生产培养基。,第五章 植物细胞工程制药,16,两步培养法,两种培养基有较大的区别，前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。 如长春花细胞培养中生长培养基与生产培养基的区别主要为前者使用了肌醇及维生素类成分，而后者则不含上述成分，在生长调节剂的使用上，前者应用2，4-D刺激细胞生长，而后者加入6-BA以便利于次级代谢产物的产生。,第五章 植物细胞工程制药,17,诱导子,植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，有些时候在被次级下才会产生抗毒素，或仅在被诱导下其产量才能增加。 触发形成植物抗毒

8、素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。,第五章 植物细胞工程制药,18,诱导子,诱导子有两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子； 另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子是指植物体在防御过程中为对抗微生物感染而产生的物质，包括分生孢子、降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、有机体产生的代谢物。 非生物诱导子是指所有不是植物细胞中天然成分但又能触发植物细胞形成抗毒素信号的物质。,第五章 植物细胞工程制药,19,诱导子,诱导子的类型与所产生的次级代谢产物的类型没有直接关系。 各种生物合成途径所必须的酶

9、也并不是对每个诱导子的刺激都产生反应。 如在园欧芹悬浮细胞培养中，UV（非生物诱导子）对黄酮生物合成过程中所涉及的酶类有诱导作用，而在苯丙烷代谢中，只有生物诱导子才能与有关酶发生反应。,第五章 植物细胞工程制药,20,培养环境的外部因素,温度： 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为2028。在一定温度（15 ）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。 低温对次级代谢产物产生的影响类似于2，4-D的抑制作用。当培养温度与培养物正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应以及对次级代谢产物产生的激活作用。 温度的变化尚可引起产物类型在质和量上的改变，个别情况下由于激活了新的生物合成途径也可

10、能产生新的代谢物质。,第五章 植物细胞工程制药,21,培养环境的外部因素,搅拌频率：植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关。 具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上。 如上述因素对海巴戟长方形细胞（累积蒽醌类成分）、产生甜菜苷（betanine）的甜菜（Beta vulgaris）细胞和累积蛇根碱的长春花细胞等的影响就非常明显。 但搅拌频率也不宜过小，如低于28r/min时，次级代谢产物的生物合成反应就有可能发生反转。,第五章 植物细胞工程制药,22,培养环境的外部因素,培养容器的影响：植物培养细胞次级代谢产物的产生可因为所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而得到不同的结

11、果。 如小规模实验室培养所用的培养容器（50500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。 用于生产次级代谢产物反应器中的搅拌器对细胞产率可产生一定的影响，这些差异及由剪切力引起的不良影响可通过使用气升式发酵罐或一个沿水平轴转动的发酵罐而予以避免。,第五章 植物细胞工程制药,23,培养环境的外部因素,光的影响：光照时间的长短、光质、光强对次级代谢产物的累积有一定的作用。 光对植物培养细胞的影响主要表现在：特殊波长的短波脉冲仅仅启动细胞的形态分化和生化过程，而连续光照则可以保持光的反应潜能或反应状态。 植物光照和激素具有协同作用或对抗作用。

12、,第五章 植物细胞工程制药,24,五、植物细胞培养的生物反应器,植物细胞的发酵培养借鉴了微生物发酵的经验，但植物细胞和微生物相比存在着很多差异。 植物细胞的直径为10m100m，比细菌和真菌细胞大10100倍。 植物细胞的纤维素壁具有较差的抗剪切能力。 植物细胞的呼吸率低，对氧的需求也低。 此外，植物细胞培养生物反应器的设计与各类植物细胞的不同生理特征和代谢方式有关，同时也与培养方式相联系。,第五章 植物细胞工程制药,25,用于植物细胞大规模培养的生物反应器,机械搅拌式生物反应器 鼓泡塔生物反应器 气升式生物反应器 转鼓式生物反应器 固定化细胞生物反应器,第五章 植物细胞工程制药,26,六、进

13、展与展望,20 世纪90 年代以来，对于植物细胞及其代谢产物的研究进入了新的发展时期，并出现了很多新技术和新方法，比如诱导子、前体饲养、两相培养法、质体转化、毛状根和冠瘿瘤组织培养等，显示了植物细胞培养工程制药的广阔发展前景。,第五章 植物细胞工程制药,27,诱导子的研究及应用,在植物细胞培养中加入诱导子可以提高次级代谢产物的产量，并可促进产物分泌到培养基中。 诱导子的作用随诱导子种类的不同而异，如在紫杉醇的细胞工程研究中，Christen等向培养基中加入高压灭活的壳囊孢菌菌丝体和青霉菌的孢子，或加入硫酸矾和3,4-二氯苯氧基三乙基胺等，可促进短叶红豆杉的悬浮细胞生长，并分泌更多的紫杉醇。,第

14、五章 植物细胞工程制药,28,前体饲养的研究及应用,前体饲喂是增加次级代谢产物产率的重要方法。 生物合成研究结果表明，次级代谢物的形成，依赖于3种主要原材料（结构范围，building block）的供应，即：莽草酸：属芳香化合物，是芳香氨基酸、肉桂酸和某些多酚化合物的前体；氨基酸：形成生物碱及肽类抗生素类，包括青霉素类和头孢菌素类；乙酸：是聚乙炔类、前列腺素类、大环抗生素类、多酚类、类异戊二烯等的前体。,第五章 植物细胞工程制药,29,两相法培养的研究及应用,两相法培养的基本出发点是在细胞外创造一个次级代谢产物的储存单元。 该培养方法可以加入固相或疏水液相，形成两相培养系统，从而达到收集分泌

15、物的目的。 该法可减轻产物本身对细胞代谢的抑制作用，并可保护产物免受培养基中催化酶或酸对产物的影响。 此外，由于产物在固相或疏水液相中的积累简化了下游处理过程。,第五章 植物细胞工程制药,30,两相法培养的研究及应用,两相法培养系统必须满足如下条件： 添加的固相（如树脂）或液相对细胞无毒害作用，不影响细胞生长和产物的合成； 产物易被固相吸附或被有机相溶解； 两相易分离； 如为固相，不可吸附培养基中的添加成分，如植物生长调节剂、有机成分等。,第五章 植物细胞工程制药,31,毛状根和冠瘿瘤培养的研究及应用,对双子叶植物病原菌根瘤农杆菌和发根农杆菌发病机理的研究，发现了两种农杆菌的原生质体中，分别含

16、有Ti质粒和Ri质粒，大小约200kb。 植物遭受感染后，农杆菌能将质粒中的一段转移DNA片段整合到植物细胞核的DNA基因编码上，作为表现型，从被感染处长出冠瘿瘤或毛状根（hairy-root）。 将冠瘿瘤或毛状根作为培养系统，可进行有机化合物的生产。,第五章 植物细胞工程制药,32,毛状根和冠瘿瘤培养的研究及应用,毛状根培养：利用发根农杆菌的转化作用进行次级代谢产物的生产，极具发展前途，其生长快速和次级代谢产物含量高，特别适用于从木本植物和难于培养的植物中得到较高含量的次级代谢产物。 毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。,第五章 植物细胞工程制

17、药,33,毛状根和冠瘿瘤培养的研究及应用,冠瘿组织培养：有些药用植物的活性成分仅在叶片和茎轴中合成，利用冠瘿组织培养易于得到这些物质。 冠瘿组织的获得，是由根瘤农杆菌感染植物组织，Ti 质粒转化后获得冠瘿瘤，经过除菌后，从冠瘿瘤培养获得的。该组织也具有激素自养、增殖速度快等特点，也可以进行液体培养。,第五章 植物细胞工程制药,34,毛状根和冠瘿瘤培养的研究及应用,转基因植物和活性成分生产：用农杆菌做载体将外源基因导入植物基因组的方法比较成熟。,第五章 植物细胞工程制药,35,七、药用植物细胞培养实例,西洋参属于五加科人参属植物，为名贵中药材之一，具有降血脂、镇静、造血及健胃作用，其所含的主要有

18、效成分为皂苷，目前尚不能人工合成，但可通过细胞培养技术来制备。,第五章 植物细胞工程制药,36,工艺流程,西洋参根,无菌根,愈伤组织,悬浮细胞培养,培养液、细胞,西洋参细胞,干粉成品,第五章 植物细胞工程制药,37,工艺过程,西洋参细胞种质选择与处理 ：取人工栽培的西洋参根，弃去所有病变、受伤及形态不规则的个体，用小刷子于流动的自来水下充分洗刷，除去根表面上所有尘粒和污物，然后将其切成50-100mm 厚的片段，浸入70%乙醇中30 秒，取出浸于5%安替福民（含有效氯5.25%的氯化钠溶液）、10%漂白粉或0.1%升汞溶液中10-20 分，取出后用无菌水充分洗去消毒剂，备用。,第五章 植物细胞工程制药,38,工艺过程,愈伤组织的诱导： 诱导西洋参愈伤组织的培养基为添加2.5mg/L 2,4-D、0.8mg/LKT 及0.7g/L 酪蛋白水解物的MS培养基。50mL 三角瓶装量为20mL，琼脂浓度为0.8%，灭菌后备用。然后取已消毒的西洋参根的片段，切成1mm 厚，4-5mm 见方的立方小块组织，再向每个培养瓶中接1g 左右的小组织块，于25-26度培养20 天后即长成愈伤组织。采用同样培养基进行移植继代培养，移植过程每瓶均用同一块愈伤组织切割分散和接种培养。如此往复循环，进行20-30 次