流式细胞检测课件

1、王丽 2015-07-07,流式细胞技术 FLOW CYTOMETRY,What does it mean?,2,FLOW CYTOMETRY ：在液流系统中，快速测定单个细胞或微粒的物理特性和生化特性的方法。 Flow Cytometer (FCM) 流式细胞仪 Flow Sorter 流式细胞分选仪,BD FACSVantage,BD Calibur,流式细胞仪,BD 流式细胞仪液流系统,3,BECKMAN CytoFLEX,Miltenyi MACSQuant,Guava 5HT 微毛细管细胞分析仪,流式细胞仪的组成,Optics,Electronics,Software,4,样品规格：

2、 96孔板 或 1.5 mL 小管,5,进样准备,工作流程,样本制备 荧光染色 上样检测 数据分析,Fluorescence Detector,Histogram,Single Cell Suspension,Cell Suspension,Fluorescently Labelled Antibody,Blue Laser (488 nm),6,液流系统,功能：传送待测样本中的细胞到激光照射区。 样本：0.2-150微米的粒子，最快可在1秒种内计测数万个细胞。,Sheath Fluid: 10 mL/Test Waste：1L / hr run 10万100万cells/Test,No Sh

3、eath Fluid Waste： 500 nm,SP 500 = PE PerCP FITC PE较强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原,21,常见荧光物质的应用,直方图和点阵图,直方图(Histogram Plot) 单参数分析. X-Axis: 荧光信号强度. Y-Axis: 细胞数目.,点阵图(Dot Plot) 双参数分析. X and Y axis：两种荧光信号强度. 每个点代表一个细胞.,Log & Lin:荧光强度的坐标可以是线性的，也可以是对数的.,直方图：可根据单一因素区分细胞亚群,70 cells each have a green fluorescen

4、ce intensity of about 400,Notice the subpopulation?,25,血细胞分群 （红细胞溶解后）,点阵图：根据多因素区分细胞亚群,荧光补偿,光谱重叠的校正： 目前使用的荧光染料都是宽波谱，两两之间的发射谱范围有一定的重叠。为了克服这种误差，可使用荧光补偿电路，设置合理的荧光信号补偿。,我需要准备什么？,1.Why ： 为什么进行流式细胞检测？ 流式细胞技术是否是最佳的检测方法？ 检测的原理是什么？ 要检测的物质是什么？ 2.Where：荧光标记的物质在哪里？ 是否需要对细胞进行固定？打孔？ 3.Which：选择什么荧光标记物？ 4.How: 样品制备流

5、程，多少个标本？（空白对照、阴性对照） 5.When: 预约（175874947群共享下载申请表） Do it！（合适的细胞密度并避免细胞结团）,27,28,应用范围,细胞绝对计数和活力分析 细胞增殖 细胞周期 细胞凋亡 细胞毒实验 抗原定量检测 线粒体膜电位检测 ,实验对照的设计,空白对照 ALL ：采用不标记的细胞进行平行测定，用于确定待测标本的基础荧光域值或检测染色方法是否成功。 阴性对照：调节各荧光探测器合适的放大倍数，即确定待测标本的基础荧光域值。常用同型对照（与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同亚型的免疫球蛋白），用于消除抗体与细胞非特异性结合产生的背景。 阳性对照：用已知

6、表达某种抗原的细胞（阳性细胞）进行平行实验，通常用于检测抗体是否正常或确定实验方法的稳定性和准确性。 补偿对照：多色分析时，将用于多色标记的各种荧光抗体分别与样本进行单色标记，以测定荧光信号的光谱重叠情况以进行调节。 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，补偿对照,29,细胞周期：从一次分裂完成时开始，到下一次分裂完成时为止，为一个细胞周期。（细胞内的 DNA 含量随细胞周期进程发生周期性变化。） DNA 含量： G1（DNA 合成前期， 2C）、 分裂间期 S （DNA 合成期，2C-4C）、 G2（DNA 合成后期，4C） 分裂期 M期（DNA 为 4C）。 利用核酸标记的方法，通

7、过流式细胞仪对细胞内 DNA 的相对含量进行测定，可分析细胞周期各时相的百分比。但是分裂期（M期）的前期、中期、后期、末期四个时期，普通流式无法进行定量检测。,30,1. DNA细胞周期分析,应用实例,1. DNA细胞周期分析,31,实验步骤及注意事项：,1、细胞周期固定： 加 200ul 细胞（贴壁培养的细胞需要先用胰酶消化）到 1.5ml 离心管中300g 转速离心 5min，并用 1PBS 清洗一次离心去上清 添加300ul PBS 溶解沉淀细胞缓慢加入20预冷的100%乙醇700ul 固定细胞（固定过程中需要边滴加乙醇，边震荡，不要产生细胞聚团，否则会严重影响实验结果）最后乙醇终浓度为

8、 70%20孵育至少 3 小时（建议 4孵育过夜，效果会更好）。 2、将固定好的细胞 300g 转速离心 5min，并用 1PBS 清洗一次。将细胞用 200ul的 Guava 细胞周期试剂重新悬浮，室温孵育 30min，注意避光。 3、用200目细胞筛过滤细胞（如果使用PI染色必须过滤），显微镜下细胞无结团，Guava 流式细胞仪检测。,32,1. DNA细胞周期分析,2.早期细胞凋亡检测,33,2.早期细胞凋亡检测结果,34,正常细胞： Annexin V(-) / 7-AAD (-) 早期凋亡细胞：Annexin V (+) / 7-AAD (-) 晚期凋亡细胞：Annexin V (+

9、) / 7-AAD (+),CD95/FASL 刺激诱导凋亡,实验步骤,1. 样本准备(贴壁细胞)：弃去培养细胞(对数生长期) 中的旧培养液，加入胰酶消化细胞，。收集旧培养基，通过离心获得凋亡或死亡细胞，与之后消化后的细胞混合，再检测。 2. 细胞染色：在 96-well 微孔板相应的孔中加入 100ulGuava Nexin（货号：4500-0450）和100ul 准备好的细胞悬液，室温避光孵育 20min；尽快用流式细胞仪获取结果（1h 内）。 流式细胞仪检测获取数据。 注意：实验最好包括实验组、阴性对照和阳性对照（凋亡诱导组）。,35,2.早期细胞凋亡检测结果,细胞凋亡,细胞凋亡是动态事

10、件，在不同时期展现不同的凋亡信号。 早期磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）暴露在细胞膜上，与 PS 结合的 Annexin V 成为检测凋亡早期的最常用指标。除此之外，线粒体膜电位变化和细胞色素 C 的释放，也被认为是凋亡的早期信号。 中期Caspase 家族蛋白分布于各条凋亡通路上，是中期凋亡的指标。活化 Caspase 蛋白检测可以使用 FLICA 底物。 晚期DNA 片段化是凋亡晚期的显著特征。通过 TUNEL 法对断裂的 DNA 片段进行标记。,36,凋亡的途径,Caspase-8 外源性 TNF-alpha/FAS 受体 Response to environmental cues,Caspase-9 内源性 细胞色素C的释放 DNA损伤或细胞周期阻滞,Caspase-3/7 关键的执行蛋白,MultiCaspase caspases 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8 & 9 的检测,Caspase家族蛋白酶是细胞程序性死亡过程中心点。,Guava Incyte IC50/EC50 自动分析,IC50 即半数抑制浓度，是