Western-Blot-结果条带全面分析

1、全面分析蛋白质印迹结果Q1。没有任何东西原因:更多。如果只使用一张没有任何显色的x光片，很可能是一级抗体加到了其他抗体上，或者是二级抗体加错了，例如兔子的添加小鼠。【解决方法】:仔细检查抗体是否添加错误，确保膜转移没有问题。【经验】:上图显示根本没有信号。如果是这种情况，大多数情况下抗体的添加是不正确的。如果中间有细带，可能的原因是蛋白质样品量太少，一级抗体浓度太低，ECL发光溶液失效。此外，如果胶片转移有问题，如胶片倒转，它自然会是白色胶片。Q2。高背景【原因】:密封性不够好，一级抗体浓度高，洗膜时间和次数不够。解决方法:降低一级抗体浓度，增加洗膜的时间和频率。【经验】:高背景可能是WB中最

2、常见的问题。目标波段是单一和清晰的，但其他地方有更多的扩散和统一的背景(连续)。事实上，只要我们注意操作规范，就很容易避免偷工减料。按规定冲洗5分钟*5次或10分钟*3次，而不是5分钟*3次或10分钟*2次。Q3。非特定波段原因:一级抗体与蛋白质的非特异性结合解决方法:更换一级抗体经验:绝大多数此类病例是由于原发性耐药性差。你不能判断哪一个是目标条。如果确实没有更好的抗体，建议使用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目标条带。当然，在这种情况下，初级抗体浓度过高导致非特异性结合的可能性非常小。Q4。具有规则边缘的白色圆圈出现在条带中【原因】:电转化过程中膜和胶之间存在气泡。【解决方法】:转移

3、胶片前，先去除胶片和胶水之间的气泡。【经验】:我们经常往盘子里倒电液。倒出的液体不能太多或太少。最佳高度是与第一层滤纸齐平。然后在滤纸上倒一些电液，用清水清洗凝胶，将凝胶涂在滤纸上，仔细检查滤纸和凝胶之间是否有气泡，并左右前后观察。在不同方向观察后，我们可以确认没有气泡。然后我们在凝胶上倒一些电液。用双手的拇指和食指，轻轻夹住聚偏氟乙烯膜两侧的中间，使膜呈U形，然后将U形的底部与胶水的中间接触，慢慢将膜向两侧放下，这样通常会有很少的气泡。然后上面的滤纸也以U形放置，用玻璃棒轻轻压下，然后用海绵覆盖。小心不要来回推动气泡，否则会产生气泡。Q5。白色出现在条的中间(突出显示)【原因】:中部高浓度的

4、辣根过氧化物酶消耗底物太快，消耗完毕后中部底物不发光。解决方法:降低蛋白质含量和一级抗体、二级抗体的浓度。【经验】:如果你够快的话，可以在中间的基板被消耗掉之前固定好x光片，但是时间很难把握。建议从降低蛋白质含量和一、二抗浓度入手。Q6。出现黑点和黑点【原因】:膜的其他部分与一级抗体或二级抗体非特异性结合解决方法:封闭的牛奶必须是纯净的，封闭后要清洗干净【经验】:我们经常等到我们发现没有牛奶的时候才想封起来，然后匆忙用PBST/TBST来配置。在匆忙的准备过程中，我们经常在没有完全溶解的情况下加入牛奶来倒薄膜，这将导致大量不溶性颗粒粘附在薄膜上，这将导致发光时薄膜上出现黑点。因此，牛奶溶解后，

5、最好休息一会儿，然后轻轻吸上层的牛奶将其密封。密封完成后，必须在加入第一种抗体前清洗三次。Q7。剥离尾矿【原因】:蛋白质量太大，一级抗的浓度和时间【经验】:这种情况很容易发生，因为很多原因会导致这种结果。一般来说，蛋白质的量是我们经过多次摸索后发现的最佳量，所以它不太可能是由过多的蛋白质引起的。最可能的原因是一级抗体浓度过高，作用时间过长。另外，洗涤第一种抗体和第二种抗体，不要偷工减料。建议将抗体和蛋白质洗涤5分钟* 5次。洗涤这么多次后，不要洗涤抗体和蛋白质。你不能用刀刮伤它。真正的抗原抗体组合不能用这种方法洗掉。Q8。出现双图像【原因】:荧光强度较高。压片时，放在一边后会轻微移动。【解决方

6、法】:放上x光片后，不要动，即使倾斜也没关系。【经验】:有时恰好是上下颠倒，双重形象会相对较弱。不要把抗体误认为是蛋白质的另一种异构形式。Q9。异质背景出现【原因】:膜可能以前用过解决方法:在操作的每个步骤中，应注意不要干燥薄膜。【使用经验】:封口时，先洗第一个抗体，再洗第二个抗体，发光时注意不要风干蛋白面。这可能是风干后的结果。注意与高背景的区别。Q10。带材的变形【原因】:气泡或不溶颗粒存在于】:大豆分离蛋白凝胶【解决方法】:配制胶水时要小心，使用无杂质的液体。【经验】:许多实验室不使用最新的设备，如用于配胶的海绵垫。如果使用多年，小气泡会从底部向顶部泄漏。当气泡足够小，胶水很快凝固时，中

7、间的小气泡会留在胶水中，影响后面胶水的流动。此外，用于配制胶水的水、十二烷基硫酸钠和Tris缓冲液应小心不要有杂质。Q11。这个带子是哑铃形的原因:胶水有问题【解决方法】:调好胶水，不要使用不合格的胶水。【经验】:哑铃最容易出现，因为胶水配置不当，凝固后胶水不均匀。我不知道你们是否有以下胶水分布。下图显示了拔出梳子后的结果。如果你拔出梳子，图的下部会呈现哑铃形。另一种可能性是，样品中含有太多未被离心的杂质，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白质自然地被推向两边。Q12。最边缘条的弯曲【原因】:电泳电流不均匀解决方法:更换新的电泳槽；不使用两侧的两个孔。【经验】:一般情况下，我们使用10孔胶水。如果你正好取样10个孔，两端的两个孔肯定会变形。此外，最好将样品放在胶水中间，使电场均匀。Q13。电泳中的现象和问题(1)整条呈“65078”状：凝胶冷却不均匀，电泳槽老化。(2)整个条带是“:凝胶的左右两端都没有凝固好。(3)溴酚蓝试验：样品溶解不好。(4)纵向纹理：样品中存在不溶性颗粒(5)溴酚蓝非常粗糙：浓缩胶的浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短或浓缩胶不匹配。(6)不能在分离凝胶中运行：三氯苯酚值错误，或忘记添加十二烷基硫酸钠。Q14。其他问题(1)蛋白质的分子量高或低。可能是胶水的浓度与目标蛋白的浓度不一致，例如，100KD蛋白用12%的胶水，20KD蛋白用6%的胶水。(2