月产一吨水蛭素提取纯化工艺设计

1、目录第一章项目总论11.1希尔的介绍11.1.1水蛭的化学结构和理化性质21.1.2水蛭的生理功能31.2希尔的应用前景31.3希尔生产技术41.3.1粗精制41.3.2砷的精制51.3.3水蛭蛋白的分析方法6第二章方案设计72.1产品方案的概要72.1.1进行产品方案的选择72.1.2对选定方案7作简要叙述2.2工艺流程82.2.1工序流程图82.2.2流程的说明82.2.3工艺流程的论证和工艺参数92.3物料平衡102.3.1技术参数102.3.2计算11第三章设备选定133.1粉碎机133.2过滤装置143.3离心装置153.4凝胶色谱装置153.5浓缩结晶装置163.6冷冻干燥装置16

2、第四章防污措施184.1工作环境184.2设备和管道的清洗和杀菌184.3废水的处理184.4废渣的处理19第五章结语19参考文献20第一章项目总论1.1希尔的介绍水蛭素(hirudin )是从水蛭(Leech )和唾液腺中提取的许多活性成分中活性最高、研究最多的成分，是一种由6566氨基酸组成的小分子蛋白质(多肽)。 水蛭素对凝血酶有很强的抑制作用，是迄今为止发现的最强的凝血酶天然特异抑制剂。 近年来，我国以砷为主要成分的中药已经有多种，如抗血栓片、活血通胶囊等，年产值达数千万元。 包括水蛭在内的新药也被研究和发售。 利用基因工程生产重组水蛭类多肽的药物，代替水蛭素，或作为抗凝固郁药的添加成

3、分，这很快就能实现。 作为注射剂用于心血管疾病和肿瘤治疗药，还需要进一步的临床研究。 不言而喻，重组水蛭素类多肽的药物的开发会带来很大的社会利益和经济利益。 砷的生产技术研究不断深入，完善砷的提取工艺尤为重要。1.1.1水蛭的化学结构和理化性质蛭(Hirudo )是蛭科动物蟾蜍(Whitmania pigra Whitman )、蛭(hirdniponicawhitman )或柳蟾(Whitmania acranulata Whitman )的干燥整体，是破血、逐渐作为常用的活血化郁药，水蛭在临床上广泛用于治疗脑血栓、冠心病、脑水肿等病，其有效成分主要是抗凝固物质，被称为水蛭(Hirudin

4、)。 阻止凝血酶对血小板的作用，抑制凝血酶刺激释放血小板，延迟或阻止血液凝固。 水蛭素是由65个氨基和3个二硫化物键组成的多肽，分子量约为7千，在干燥状态下稳定存在，在室温下在水中稳定存在6个月，提高在80 下加热15 min也不被破坏的溶液的pH，稳定性降低的20 下为0.1 mol/L水蛭素是一种有前途的抗凝血郁药，可用于治疗各种血栓，特别是静脉血栓和弥漫性血管凝固，在外科手术后预防动脉血栓形成，也可用于预防血栓溶解后和血管重建后血栓形成，改善体外血液循环和血液透析过程。 显微外科手术经常因吻合部的血管栓塞失败，采用砷素促进伤口的愈合。 发现水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。 可以阻止肿瘤细

5、胞的转移，有治疗效果的肿瘤，如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑色素瘤和白血病等。 水蛭素还能配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流来提高治疗效果。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素无明显副作用，急性、亚急性毒性试验不受血压、心率、血液相、出血时间和血液化学成分的影响，对呼吸系统无影响，无过敏反应，一般未见特异抗体。 半致死量LD5050mgAg，远多于用于治疗的量(1mgAg )。 特别是有人指出，水蛭素可以口服，非常方便用药。 砷相对稳定，胰蛋白酶和糜烂蛋白酶不损害其活性，砷的水解片段具有抑制凝血酶的作用，可以说明为什么口服中药蛭提取液也有效果。1.1.2水蛭的生理功能动物实验和临床研

6、究表明，水蛭素对凝血、抗血栓形成、阻止凝血酶催化剂的凝血因子的激活和血小板反应等进一步的血瘀现象有效。 另外，还可以抑制凝血酶诱导的成纤维细胞的增殖和凝血酶对内皮细胞的刺激。 与肝素相比，不仅少量不引起出血，而且也不依赖内源性辅助因子的肝素有引起出血的危险性，在扩散性血管内凝固的发病过程中凝血酶多减少，限制肝素的治疗效果，采用水蛭有很好的效果。 天然水蛭是由65或66个氨基酸残基组成的单链多肽，分子量约为7千，能在极端的pH和热条件下稳定存在。 水蛭素的形状与蝌蚪相似，蝌蚪的头部在多肽的n末端，富含半胱氨酸(cys )，半胱氨酸之间相互作用形成3个二硫化物键(Cys6-Cys14、Cys16-

7、Cys28、Cys 22 - 。 n末端结构紧密的蝌蚪尾部是含有多个酸性氨基酸和磺化酪氨酸(Tyr63 )的多肽c末端。 凝血酶是凝血和止血过程的中心酶，也可以激活能剪切纤维蛋白原，将纤维蛋白原转化成纤维蛋白原的凝血因子v、vi、vi和抗凝血酶C(Fenton，1981 )等其他凝血血液的酶类。 凝血酶与高分子基质的相互作用是三个不同区域：的催化反应部位的一次结合部位C(Magnusen，1971 )，与催化部位相邻的非极性结合部位AB(Brlinr and Shen，1977； Sonder and Fenton，1984 )、凝血酶和纤维蛋白原发挥特异性作用的阴离子结合部位(识别部位) R

8、(Fenton et al.1989； Henriksen and Mann，1988 )。 砷素的n末端可以阻断凝血酶的活性部位，其疏水结构区与凝血酶的非极性结合部位(AB )互补，该非极性结合部位接近凝血酶的催化剂中心。 水蛭c末端有6个酸性氨基酸，能与带正电的凝血酶识别部位形成很多离子键。 n端、c端两个功能域协同结合凝血酶，在凝血酶的活性部位形成帽子，阻止基质的结合。1.2希尔的应用前景水蛭素是一种很有前途的抗凝血郁药，可用于治疗各种血栓，特别是静脉血栓和弥漫性血管凝固，在外科手术后可预防动脉血栓形成，也可用于预防血栓溶解后和血管重建后血栓形成，改善体外血液循环和血液透析过程。 显微外

9、科手术经常因吻合部的血管栓塞失败，采用砷素促进伤口的愈合。 发现水蛭素在肿瘤治疗中也能发挥作用。 可以阻止肿瘤细胞的转移，有治疗效果的肿瘤，如纤维肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑色素瘤和白血病等。 水蛭素还能配合化疗和放疗，通过促进肿瘤中的血流来提高治疗效果。动物试验和临床研究表明，静脉或皮下注射水蛭素无明显副作用，急性、亚急性毒性试验不受血压、心率、血液相、出血时间和血液化学成分的影响，对呼吸系统无影响，无过敏反应，一般未见特异抗体。 半致死量LD5050mgAg远远多于用于治疗的量(1mgAg )。 特别是有人指出，水蛭素可以口服，非常方便用药。 砷比较稳定，胰蛋白酶和糜烂蛋白酶不损害其活性，砷

10、的水解片段具有抑制凝血酶的作用，可以说明为什么口服中药蛭提取液也有效果。近年来，我国以砷为主要成分的中药已有多种，如抗血栓片、活血通胶囊等，年产值达数千万元。 包括水蛭在内的新药也被研究和发售。 利用基因工程生产重组水蛭类多肽的药物，代替水蛭素，或作为抗凝固郁药的添加成分，这很快就能实现。 作为注射剂用于心血管疾病和肿瘤治疗药物，还需要进一步的临床研究。 不言而喻，重组水蛭素类多肽的药物的开发会带来很大的社会利益和经济利益。1.3希尔生产技术水蛭素的分离提取方法有很多1.3.1粗精制盐析沉淀法：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显着影响。 低浓度时，中性盐能提高蛋白质的溶解度，这种现象称为盐溶。 盐

11、溶解作用主要是在蛋白质分子吸附某一盐类离子后，带电层拒绝蛋白质分子，蛋白质分子与水分子的相互作用增强，从而提高溶解度。 球蛋白溶液在透析中沉淀析出的情况较多，是因为通过透析除去盐类离子，蛋白质分子间的相互吸引增加，引起蛋白质分子的凝聚和沉淀。 溶液的离子强度增加到一定值时，蛋白质的溶解度开始降低。 离子强度充分提高时，例如饱和或半饱和程度的大量蛋白质从水溶液中沉淀的现象被称为盐析(salting out )。 盐析作用主要是通过添加中性盐降低水的活性度，本来溶液中的大部分或全部自由水分子变成了下一步最能自由利用的水分子，因此为了用溶剂溶解盐离子而被去除，留下露出的疏水基。 随着盐浓度的增加，蛋

12、白质的疏水表面进一步露出，疏水作用蛋白质凝聚沉淀。 盐析沉淀的蛋白质保持其自然结构，能再溶解。 用于盐析的中性盐以硫酸灰心为最佳，在水中溶解度高，溶解度的温度系数低。有机溶剂沉淀法：位于等电点附近，蛋白质分子主要以偶极子离子存在。 此时，如果添加有机溶剂，由于有机溶剂的介电常数低，所以溶液的介电常数减少，双极离子间的静电引力增强，分子凝聚而沉淀。pH沉淀法：蛋白是一种带正电荷和负电荷基的两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和量随pH值的变化而变化。 蛋白质处于等电点时，净电荷为零，相邻的蛋白质分子间没有静电排斥力，容易沉淀。 因此，当其他条件相同时，溶解度达到最低点。 在等电点以上或以下的pH值下

13、，蛋白质分子具有同种符号的净电荷相互排斥，阻止单个分子沉淀，因此溶解度大。 不同的蛋白质具有不同的等电点，利用蛋白质在等电点最低的原理，可以分离蛋白质混合物。 如果pH调节至蛋白质混合物中某成分的等电点pH，则大部分或全部蛋白质就会沉淀，高于或低于该pH的蛋白质就会残留在溶液中。 这样沉淀的蛋白质保持着自然结构，可以再溶解在适当的pH值和一定浓度的盐溶液中。丙酮提取法：水蛭素的提取分别按以下顺序提取。 希尔伯特3360浓盐酸：丙酮=1:0.02535252525252525252525252525252525252 535353535353 48小时后滤取丙酮，用2. 5倍的丙酮提取残渣48小

14、时，过滤，合并丙酮提取液。 残渣用适量的丙酮洗涤一次并合并，在80加热到85，去除杂质，浓缩回收丙酮，得到浓缩物，过滤砷粗品。1.3.2砷的精制1.4.1离子交换色谱(IEC):离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography简称IEC )以离子交换剂为固定相，根据流动相中的成分离子和交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力的大小的不同1.4.2凝胶过滤色谱(GF):凝胶过滤色谱是60年代发展的分离纯化方法，凝胶过滤又称分子筛色谱、凝胶渗透色谱、阻隔色谱等，对生物高分子和有机多聚体进行分离分析很有用凝胶过滤的机制是分子筛效果，凝胶过滤是液相色谱，以具有一定孔径的多孔凝胶为支

15、撑体，使用的基质是具有立体网状结构，筛孔径一致，呈珠状粒子的物质，该物质可以对某些高分子化合物完全或部分地进行抵抗， 对某些小分子化合物无法抵抗，自由扩散、渗透到筛孔中，混合溶液通过凝胶过滤色谱柱后，溶液中的物质以不同的分子量被筛分。1.4.3仿射色谱(HIC):仿射色谱是利用分离物质与其特异配体之间具有特异亲和力，实现分离目的的特殊色谱技术。1.3.3水蛭蛋白的分析方法蛋白质含量测定采用双缩脉法，砷活性测定采用凝血酶滴定法，对所得到的砷溶液用SDS-PAGE (聚丙烯酞菁电泳)和RP-HPLC (反相高效液相色谱)法进行分子量的分布测定和纯度验证。第二章程序设计2.1产品方案提取的概要蛋白质

16、由亲水性和疏水氨基酸组成，其中大部分疏水氨基酸集中在蛋白质内部，一部分分布在蛋白质表面形成不同的疏水区域。 蛋白质沉淀是一种有效浓缩和纯化蛋白质的方法。 这是通过减少蛋白质在溶液中的溶解度，使其与其他物质分离。 具有一定的选择性，达到浓缩去除杂质蛋白质的目的，使目标蛋白质的保存和进一步处理变得容易。蛋白质粗精制在蛋白质的分离精制整体上占重要位置，通过前期的粗精制，活性回收率大，精制倍率高，溶液比较澄清的蛋白质为下一次分离精制提供了很好的条件。 蛋白质粗纯化的基本方法有盐析法、有机溶剂沉淀法、pH沉淀法等，各种方法分离纯化不同蛋白质各有优缺点。2.1.1进行产品方案的选择天然砷产生于水蛭唾液腺，提取水蛭素的方法是以水蛭素头部为原料进行的。 用硫酸铵分级沉淀法进行砷的粗提取，用凝胶色谱测定砷，脱盐，样品浓缩，得到精制的砷。2.1.2对选定方案作简要叙述据文献报道，通过比较几种方法，pH沉淀法蛋白质回收率为45.58%，活性回收率为55.55%，纯化倍数为1.22，比较活性为6.41 AT U/mg，虽然得到的砷粗提取液比较澄清，但其纯化倍数相对较低，该方法体积比较大的na 温和环境下的溶液太稀，为了得到更好的浓度可能需要进一步的处理，另一方面，有机溶剂沉淀法的蛋