大肠杆菌的培养和分离PPT课件.ppt

1、微生物的利用,1,特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.,基础知识： 微生物,：是一切肉眼看不见或看不清楚的微小生物的总称,2,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。 菌落是鉴定菌种的重要依据。, 菌落,3,实验目的 1.进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。 2.进行大肠杆菌的分离，用固体平面培养基进行细菌的划线培养。 3.说明大肠杆菌培养的条件和操作要求的原理。,实验一、大肠杆菌的培养和分离实验流程,4,

2、配制培养基,包器材,灭菌,倒平板,接种扩大培养,分离,菌种保存,大肠杆菌的培养和分离实验流程,制作LB培养基（液）,5,培养基成分及其作用,另外还需要满足微生物生长对pH、温度、渗透压等的要求。,6,培养基的类型 分类： 液体培养基 物理状态 固体培养基 半固体培养基 选择培养基 功能 鉴定培养基,琼脂,（扩大培养 ）,（分离、鉴定、计数、保存菌种）,7,1计算、称量,LB固体培养基的配制,8,2溶化,9,3调pH： pH76,10,4. 分装、加塞、包扎,5灭菌:,11,6倒平板: 待培养基冷却到60 左右时，在酒精灯附近倒平板,7无菌检查： 37恒温培养箱中培养2448小时，以检查灭菌是否

3、彻底。,12,灭菌操作,目的：所利用的微生物不被其他杂菌污染， 成功地培养微生物的关键。,消毒：杀灭部分微生物,（1）无菌操作：消毒与灭菌的区别,灭菌：杀灭所有微生物，包括芽孢，孢子,13,1器皿,无菌操作,2培养基,3操作,14,高压蒸气灭菌： 121 （1kg/cm2）15min.,1器皿,15,2培养基,(1)含葡萄糖：高压蒸汽灭菌法 （90（500g/cm2）30min）,(2)含尿素：G6玻璃砂漏斗过滤灭菌,16,3操作,超净台：紫外灯，过滤风,手：酒精消毒,接种环：灼烧灭菌,玻璃刮刀,17,灼烧灭菌,18,请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （

4、1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3） 实验操作者的双手,答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,1,19,（二）分离大肠杆菌,接种方法有： 划线分离法 涂布分离法,微生物的接种技术：,20,划线分离法,21,22,23,每次划线之前都要灼烧接种环,24,25,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,问题讨论,（1）第一步灼烧是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物； （2）每次划线前灼烧是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源上次划线的末端

5、，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌体的数目逐渐减少，分散得到单个细菌，获得单菌落。 （3）划线结束后灼烧，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,26,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进 行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；,3.为什么要轻轻的划线，不能划破培养基,27,涂布分离法,28,29,30,31,32,配制培养基,灭菌,倒平板,接种,37恒温培养箱倒置培养,4冰箱菌种保存,大肠杆菌的培养和分离实验流程,33,接种前准备,紫外灯和过滤风杀菌30min 用肥皂洗手并使用酒精消毒。 顺序：点燃

6、酒精灯酒精棉擦拭双手酒精棉擦拭桌面,接种过程P22,34,菌种扩增,37摇床震荡培养12h（于LB液体培养基中）,35,配制培养基,包器材,灭菌,倒平板,接种扩大培养,分离,菌种保存,实验流程,36,菌种的保存,1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4冰箱保存。 2、长期保存：甘油冷冻管藏法,37,倒平板技术,38,1.培养基灭菌后，需要冷却到60 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,问题讨论,答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物

7、污染培养基。,2.为什么要在酒精灯火焰旁操作？,答：酒精灯火焰旁有无菌区域,39,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，正放培养皿会使水蒸气凝结成水滴后，落入培养基的表面并且扩散，菌落中的细菌也会随水扩散，菌落间相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。,40,分析与讨论: 3、实验完成后，接触过细菌的器皿应如何处理？,完成实验后，所有接触过细菌的器皿都必须先经过高压灭菌后再洗涤，特别是培养基有可能被有害菌体污染，在培养繁殖后，大量有害菌体会影响人畜健康，也会污染环境，因此必须高压灭菌。使用后的废弃物也要经过高压灭菌后再丢弃。对于取样器的取样头，通常是灭

8、菌后在超声波清洗器中加洗衣粉洗涤30min，再永清水洗净，仍可再用。封口膜也可重复使用。,41,分析与讨论: 1、如何操作才可以尽量避免被杂菌污染？,（1）胆大心细，操作快捷 （2）注意灭菌操作原则，灭菌要彻底，尽量降低环境污染几率，手和实验服要保持清洁，合理地减少操作时间，对污染源的改善要考虑周到 （3）注意微生物的生长条件，如pH、渗透压、温度等。细菌喜中性偏碱性环境，喜蛋白质丰富的物质营养，喜37的温度；而霉菌喜中性偏酸性环境，喜糖类丰富的物质营养，喜25-30的温度。,42,分析与讨论: 2、在培养后如何判断是否有杂菌污染？,（1）从菌落的形态看，是否湿润、透明、黏稠，呈何种颜色等，是

9、区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标 （2）用显微镜镜检观察其形态、大小，看是否有菌丝、孢子、芽孢等，这也是区别细菌、酵母菌、放线菌和霉菌的关键指标 （3）上述方法较难区分同类的不同菌种，这时就需要借助化学方法和进一步的形态观察，如用革兰氏染色法，观察孢子形态、孢子着生方式、菌丝生长方式、有无鞭毛、芽孢、毒素及特异生理生化性质等,43,分析与讨论: 4、如果分离的是转基因的大肠杆菌，如何保证不被普通的大肠杆菌所污染？,转基因用的质粒，不是细菌中原有的质粒，而是通过改造的，通常加入了抗性基因的DNA序列，如抗氨苄青霉素基因。转基因载体（质粒）转化进入大肠杆菌后，能在含有氨苄青霉素的培养基中生

10、长，而未被转化的就不能生长，其它没有抗氨苄青霉素基因的杂菌也不能生长，这种设计保证了转基因工程菌的纯洁性。在获得转基因工程菌后，如果为了选择高表达量菌株等进行分离，也可使用含抗生素的培养基，这就保证了转基因工程菌不被普通（无抗性基因）的大肠杆菌所污染。,44,【课堂练习】,例1关微生物营养物质的叙述中，正确的是（ ） A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,D,45,例2下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是（ ） A.防止杂菌污染 B.接种前菌种要进行灭菌 C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前,B,46,例3右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （1）右表培养基可培养的微生物类型是 。 （2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。 如不想浪费此培养基，可再加入 .,自养型微生物,含碳有机物,47,（3）若除去成分，加入（CH2O），该培养基可用于培养 。 （4）表中营养成分共有 类。 （5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是 。 （6）右表中各成分重量确定的原则是 。 （7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分 。,固氮微生物,3,调整pH,依微生物的生长需要确定,琼脂（或凝固剂）,48,例右表是某微生物培养基成分，请据此回答： （1）右表培养基可培养