TBE-300B型高速逆流色谱分离仪

1、TBE-300B型高速逆流色谱分离仪 2015.01.06,目录,高速逆流色谱发展历程 高速逆流色谱原理及应用 溶剂体系的选择 系统组成及流路连接 仪器的操作 常见问题及解决方法 定期清洗维护,高速逆流色谱发展历程,高速逆流色谱 ( high -speed counter -current chromatography , HSCCC ) 是由美国国立卫生研究院 (National Institute of Health, NIH ) 的 Yoichiro Ito博士于20世纪80年代发明的一种基于液-液分配机理的新型色谱分离纯化技术。高速逆流色谱用于天然药物化学成分的分离始于1985年,到1

2、988年、1989年达到一个高潮, 期间发表了大量的文章。经过几十年的实验研究, 特别是近十多年高速逆流色谱的发展, 使得它在生物工程、 医药、生化、植化、农业、化工、环境、海洋科学 、无机化学等广泛领域显现出越来越高的实用价值。 我国还是继美国、日本之后最早开展逆流色谱应用的国家, 也是世界上高速逆流色谱仪生产国之一。HSCCC被北京新技术应用研究所的张天佑教授和上海同田生化技术有公司的邓秋云先生进一步改进。 引用文献： 姚舜, 柳仁民, 黄雪峰,等. 高速逆流色谱在天然产物分离中的方法学研究J. 中国天然药物, 2008, 6(1) : 13-19.,高速逆流色谱原理,高速逆流色谱(hig

3、h-speed counter-current chromatography, HSCCC）是一种连续高效的液 - 液分配色谱技术。由于不需要固体支撑体, 物质的分离依据其在互不相溶的两相液体中的分配系数的差异而实现, 因而避免了固体固定相不可逆吸附而引起的样品损失、 失活、 变性等问题, 样品回收率高, 回收的样品更能反映其本来的特性, 特别适合于天然产物中有效成分的分离。 利用螺旋柱在行星运动时产生的离心力，使互不相溶的两相不断混合，同时保留其中的一相（固定相），利用恒流泵连续输入另一相（流动相），此时在螺旋柱中任何一部分, 两相溶剂反复进行着混合和静置的分配过程，流动相不断穿过固定相,

4、随流动相进入螺旋柱的溶质在两相之间反复分配，按分配系数的大小次序，被依次洗脱,高速逆流色谱仪器的装置如图 1 所示, 它的公转轴水平设置, 螺旋管柱距公转轴 R 处安装, 两轴线平行。通过齿轮传动, 使螺旋管柱实现在绕仪器中心轴线公转的同时, 绕自转轴作相同方向相同角速度的自转。 引用文献：李爱峰, 刘宁宁, 柳仁民. 高速逆流色谱原理及其在天然产物化学成分分离中的应用研究进展J. 理化检验-化学分册, 2008, 44(5) : 481-489.,高速逆流色谱应用,目前，应用高速逆流色谱法在提取分离天然产物中的黄酮、生物碱、香豆素、萜类、木脂素、皂苷、多酚类和蒽醌类衍生物等有效成分方面已获得

5、满意结果。 柳仁民等采用高速逆流色谱分离纯化秦皮中香豆素成分，以正丁醇-甲醇-0.5%乙酸（5：1.5：5，v/v）为两相溶剂系统，经过单次分离，从150mg秦皮粗提物中分离得到14.3mg的秦皮苷(fraxin)、26.5mg的秦皮甲素(f aesculin)、5.8mg的秦皮素(fraxetin)、32.4mg的秦皮乙素(aesculetin)，纯度分别为97.6%、99.5%、97.2%、98.7%,引用文献：Renmin Liu , Qinghua Sun, Ailing Sun,等. Isolation and purification ofcoumarin compounds fr

6、om Cortex fraxinusby high-speed counter-current chromatography.Journal of Chromatography A, 1072 (2005) 195199.,牛丹丹等应用高速逆流色谱法首次从花生壳中分离制备了3种黄酮类化合物。以正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水-冰醋酸( 5: 3: 3. 5: 5: 0. 25, v /v)为两相溶剂系统, 在主机转速800 r /m in、流速2 mL /m in、检测波长275 nm 条件下进行分离制备, 纯度用HPLC 法测定, 各化合物结构经质谱和核磁共振氢谱、碳谱鉴定。结果表明, 100 m

7、in内从70 mg 花生壳粗提物中一步分离制备得到木犀草素11.0 mg, 香叶木素2.2 mg, 5, 7-二羟基色原酮5.2 mg, 其纯度均达96. 0% 以上。,引用文献 牛丹丹, 刘彩霞, 刘绣华,等. 高速逆流色谱法分离制备花生壳中的黄酮类化合物J. 天然产物研究与开发, 2011, 23 : 110-113,158.,溶剂体系的选择,溶剂体系的选择原则 (1 ) 溶剂系统不会造成样品的分解或变性; (2) 足够高的样品溶解度; (3) 溶剂系统不会干扰样品的检测。 (4) 各个组分在其两相的分配系数在 0 .5 5 之间, 且有一定的差值。 (5) 溶剂系统的分相时间不超过 30

8、 s。 (6) 尽量采用沸点低的溶剂, 以方便后续处理。 (7)尽量避免使用毒性大的溶剂 引用文献：刘宁宁, 李爱峰, 柳仁民. 高速逆流色谱在分离纯化中草药黄酮类成分中的应用J. 化学试剂, 2008, 30(5) : 346-350.,溶剂体系的选择原则如下表所示,引用文献：曹学丽.高速逆流色谱技术及应用M.北京: 化学工业出版社，2004: 44.,溶剂体系的选择方法 溶剂体系的选择方法有多种, 如参比已知的溶剂体系、 HPLC法、测定分配系数、薄层色谱法( TLC) 、 生物活性物质分配比率法、 分析型HSCCC法等。目前较为常用的方法为 HPLC 法和 TLC 法。 薄层色谱法( T

9、LC) 样品在 等体 积上 下相 中分 配 达到 平衡 后,T LC 展开, 通过斑点大小或颜色深浅来判断各组分在两相间的分布状况。,HPLC 法 该法是利用样品组分在有机相和水相的色谱峰面积之比测定分配系数 K 值的。具体做法如下: 将样品溶于一 定体积的某一相中( 例如上相U) , 然后利用 HP LC 测定上相溶液, 得到色谱峰面积 AU1; 另外加入一 定体积 的另一相( 例如下相L) , 振荡, 当达到分配平衡后, 取该溶液的上相进行 HPLC 测定, 得到色谱峰面积 AU2, 如图 1 所示。对于同一组分, 其分配系数 K 可以表示如下:,引用文献：刘宁宁, 李爱峰, 柳仁民. 高

10、速逆流色谱在分离纯化中草药黄酮类成分中的应用J. 化学试剂, 2008, 30(5) : 346-350.,系统组成及流路连接,系统组成,流路连接,（1）将泵的过滤头放在配好的溶剂内。 （2）泵出口引出的输液管，通过接头连接到TBE-300B主机的In(进柱口)接头上，旋紧接头，使之不漏液。 （3）主机上out（出柱口）接口引出的一根输液管，通过接头接在紫外检测器流通池的入口处。 （4）最后，在检测器的出口端放置收集瓶收集流分。 注意事项： 轻相做固定相，采用正接正转。 重相做固定相，采用反接正转 or 正接反转。,仪器的主要性能指标和使用环境,主机管路体积：280 ml 转速范围：0-100

11、0 rpm/min；工作转速：800-1000rpm/min 流动相工作流速：2-4 ml/min（推荐） 进样圈：20ml 最大工作电压：2Mpa（20公斤力/平方厘米） 电压：220+20 V ；频率：50Hz 主机尺寸：330 x 600 x 550mm ；主机重量：80Kg 使用和保存环境：高度小于海拔3000m、相对湿度小于80%、工作环境温度15-30 。 注意事项： 处理后的样品必须没有明显的可见颗粒。 主机运行时，请把主机侧门锁好，以防发生意外情况 请勿让仪器在管路没有液体的情况下长时间高速空转。,仪器的操作,准备工作,平衡体系,样品分离,仪器清洗,准备工作 配液的玻璃仪器（分

12、液漏斗，量筒等）要求清洗干净，按比例配好固定相和流动相，倒入分液漏斗中，充分震荡23次(至少)，静置使分层，后分别将两相移入干净干燥的试剂瓶中，放入超声震荡仪中超声脱气20min左右，脱气后静置至室温待用。 完成各仪器的电源、信号线和液体流路的连接。,开启循环水浴，设定好恒温温度，然后启动仪器制冷，恒温循环器稳定工作后，就能使主机在较为稳定的温度下进行样品分离。 注意事项： 主机在旋转前一定要开启循环水浴， 以免主机仪器的齿轮受热膨胀变形。 恒温循环器中，推荐使用蒸馏水作为热交换介质， 蒸馏水需定期更换。 恒温循环器的温度的设定最高不得超过40。,平衡体系 （1）开启泵，以1030ml/min

13、流速将已脱气好的固定相从主机管路进口处泵入，当固定相从管路出口处流出约30ml后，停泵，此时主机管路内充满了固定相 注意事项： 固定相和流动相溶液在使用前，需超声脱气20min左右。 需要有足够量的固定相溶液，保证泵的过滤头始终浸没在固定相液体内，以防泵入空气。 泵的过滤器应定期清洗。 配套的泵，必须设置压力保护部大于2MPa。 流体的压力应该小于2MPa，以防主机爆管。,（2）将泵入口管路上的砂芯过滤器放入流动相内，启动泵，以预定流量（推荐流量为3ml/min）从进柱口泵入流动相，在出液端用干净的量筒接液，计算所选体系的固定相保留率。此时，可打开紫外检测器进行预热。 注意事项：泵入上相时需检

14、查 进样六通阀的手柄须拨到inject档。 管路是否泄漏，如有泄漏请按如下处理： 各管路接头是否有泄漏，泄露处需拧紧。若接头拧紧后还有泄漏，检查管子的密封端面是否磨损，若有磨损，须重新制作密封端面。 管路是否堵塞，若管子堵塞，此时泵压会缓慢上升，当压力超过2MPa时，有可能会损坏柱子，所以在发现管子堵塞后，须立即停泵，并检查管路，排除堵塞故障后方可继续工作。,（3）接通主机电源，按变频调节控制器面板上的FWD键启动电机，此时主机的旋转方向为正转，缓慢调节变频调节控制器面板上的转速调节旋钮，使主机的转速由低到高缓慢的提高，达到所需的转速，并保持主机在此转速下平稳的旋转（反转操作与此相同） 注意事

15、项： 主机旋转时，请按低速到高速缓慢增加，停机时按高速到低速缓慢减低至停止。 仪器长期放置不用时，请将恒温模块中的水全部从排水口放出。 开始泵入流动相时或待出液端有流动相流出时，建议打开电脑上的高速逆流色谱工作站，根据基线平稳情况选择进样时间（固定相和流动相在管柱内混合时引起基线波动）,主机变频调节控制器面板示意图,样品分离 （1）称取待分离样品。 （2）将样品溶解完全，无明显可见颗粒（样品既可用流动相或固定相溶解，也可用两相混合溶剂溶解） （3）用溶解样品的相润洗进样注射器及拐点（将溶剂倒入进样注射器内，用另一注射器将其在inject处的引出管路抽出即可） （4）把2号六通阀的手柄拨到loa

16、d处（拨手柄时，速度要快，以防管路不通或暂时压力过高胀破进样阀管路） （5）装入样品，用注射器把样品圈尾部的气泡排除干净（见气泡冒出且进样注射器内液面上升，无气泡为宜）；将注射器中样品溶液回抽入定量环中（2号六通阀inject处有一个引出的管路由此抽样品） 注意事项：不能将样品溶液全部抽完，要使盛样品的注射器有一层液，防止吸入气泡。,（6）把2号六通阀拨到inject档，同时调整好检测仪和色谱工作站的参数，记录下色谱图并收集流出的各个样品组分。 （7）收集完流动相的各组分后，停止主机运转、接入气管将管路中的液体排出（用气体和液体均可）。 注意：此时可收集固定相中的样品组分。 （8）清洗六通阀进

17、样管路： 用注射器将清洗液抽入到注射器中（2号六通阀inject处有一个引出的管路，由此抽入清洗液） 将抽入到注射器中的清洗液倒入废液缸,仪器清洗 （1）往吹干溶剂体系的管路内，用最大流速泵入约50ml100ml清洗液，停泵 （2）断开泵与主机的连接，把主机与气源连接，把清洗液从出口处吹出 （3）视分离管的污染程度，可重复清洗1-2次。 （4）待清洗液吹完后，继续向管路吹气，以使残存在管路内的清洗液吹出或挥发干净。 注意事项： 主机内溶液含有盐或缓冲溶液时，须先用蒸馏水冲洗12次，根据样品性质选择清洗液，可用甲醇、乙醇等；清洗时，可把检测器与主机连接起来，以便同时清洗检测器的流动池。 本仪器适

18、用于有机溶剂，316L不锈钢及PTFE管子可耐受的酸碱溶液。 仪器管系的最大允许压力为2Mpa，约每平方厘米20公斤力。超出此值，仪器管系可能损坏泄漏。,常见问题及解决方法,管路中不断有气泡产生 把配好的上下相分别进行超声脱气20min。 检查管路中各接头是否有泄漏的地方，找到泄漏处后，拧紧接头或重新做密封端面。 超声脱气后的试剂需静置放凉至室温后再平衡泵液。 设备清洗吹气后不宜立即泵液，待主机内的负压消除后再进行实验。 管路中有固定相流出 体系是否稳定，是否已平衡好，待平衡好后再进行实验。 进样量过载的情况下易产生固定相流失，可减少进样量。 样品性质影响流失。 清洗不干净或主机内有残留液，彻

19、底清洗后排除。,当管路发生堵塞时 仪器的管路堵塞，先检查堵塞部位，一般都发生在管路接头处，一旦发生管路堵塞，易引起管路破裂，这时请立即停泵，并停止主机的旋转；如果因由固体小颗粒造成堵塞的，请立即排除。如果不是请将主机低速（300 rpm）反转5-10 min，一般都能解决管路堵塞的问题。 在上述步骤不能解决堵塞问题时，可在仪器入口处输入压缩气体，将液体从内部管路吹出，并将设备低速反转；再将压缩气体接入出口处吹液体，并将设备低速正转，反复进行几次，直至将液体全部吹出后，清洗管路。建议溶解样品时，溶剂内至少不要有能用肉眼看到的较大样品颗粒（同管内径相比较），最好样品都能完全溶解在溶剂内。 每次仪器

20、在工作完毕之后，需清洗仪器管路，并按规定在仪器使用三个月时间后，彻底清洗仪器管路。 注意：出现管路堵塞问题时，请密切注意主机压力。,仪器内部有液体渗漏 管路连接接头渗漏 如果接头未旋紧造成渗漏，将接头旋紧后在进行实验. 如果接头端口聚四氟乙烯管所做成的密封端面破损，造成连接不密封渗漏，将破损处切除后，重新做密封面，连接接头时旋紧力适中，避免将密封端面压破。 当由连接管路破损造成漏液时，拆下已破损的连接管路，并更换上新的连接管路。 主机内分离柱内部管路破损，发生此种情况时，需更换分离柱，请及时与专业维修人员联系。,注意事项: 主机在安装或移动位置时，需保持放置台面的水平，以防仪器在工作时产生大的

21、振动。 仪器在开始运转前，一定要开启恒温循环器。 仪器在开始运转时，切记必须从低转速缓慢调整到高转速，直至所需转速。 仪器要从正转改变为反转时，必须先使主机由正转缓慢减速至完全停止，然后按变频器操作面板上的停止键”STOP”,然后按反转键，并缓慢提升主机反转转速直至所需转速，反之亦然。 主机管路为空时，最好不要使主机长时间旋转，如果确需旋转时，转速以低于300r/min 为宜。 恒温循环器的温度设定绝对不能超过40。,定期清洗维护,仪器在正常使用一段时间后，分离管柱的内壁可能会附着一些样品沉淀物，这些沉淀物一旦被溶剂洗脱落，会影响样品的分离程度并造成管柱堵塞，以致管柱破裂，所以，正常使用中的仪器推荐定期清洗分离管柱，以防止上述现象的发生。定期清洗分离管柱的过程如下： 配制0.5%的稀氢氧化钠溶液60ml，用泵泵入分离管柱内，停泵，用气体将氢氧化钠溶液缓慢吹出管柱。 用泵把100ml约85的热水泵入管柱内，以清洗管壁上残存的碱液，停泵，然后用气体将水缓慢吹