用HPLC-ESI-MS对加速样品进行分析

1、液相色谱-质谱联用技术 在药品质量控制中的应用,天津市药品检验所 吴燕,一、液相色谱-质谱联用技术介绍,1、概述,高效液相色谱一质谱联用法(High Performance Liquid ChromatographyMassSpectrometry，HPLCMS)是一种将待测样品通过液相色谱分离后，流出液经接口部分或全部进入离子源。所产生离子在加速电压的作用下，进入质谱质量分析器，按照离子的质荷比大小分离并列谱的分析方法。HPLCMS适用于极性强、挥发度低、分子量大及热不稳定的混合有机物体系。,与气相色谱质谱联用技术( Gas Mass Spectrometry)相比，气相色谱质谱联用技术发展

2、较早，技术较为成熟，但GC样品要求有一定的蒸汽压，实际应用中只有少部分样品可以不经过预先处理可达到GC的分离要求，多数情况下需要做预处理或衍生化使之成为易气化的样品才能进行GC-MS分析；而液相色谱不受上述限制，可分离高极性的和热不稳定的化合物，这使得液相色谱质谱联用技术具有更广阔的应用前景 。,2、液相色谱-质谱联用技术的特点,高效液相色谱是以液体溶剂作为流动相的色谱技术，一般在室温下操作，可以直接分析不挥发性化合物、极性化合物和大分子化合物（包括蛋白、多肽、多糖、多聚物等），分析范围广，而且不需衍生化步骤。 质谱是化合物(或单质)固有特性之一，不同的化合物除一些异构体外，均有不同的质谱，利

3、用这一性质可进行定性分析。,对于色谱工作者来说，质谱仪的使用可以：,1、作为液相常规检测器（紫外、荧光、电化学等 等）的补 充； 2、质谱仪是通用性检测器，响应值与分子中的某个特定基团无关； 3、质谱仪是质量数型检测器，可以获得待测物的分子量信息； 4、质谱仪可同时提供定性和定量分析的结果。,对于质谱工作者来说，与液相色谱联用可以：,1、分析不能用GC测定的化合物（大分子、极性、热不稳定性化合物）； 2、通过液相的高分离性能，提供更多的有关物质结构信息； 3、通过流动注射技术，实现全自动的探索分析。,3、液相色谱-质谱联用仪组成及原理,高效液相色谱一质谱联用仪(HPLCMS)通常由液相色谱系统

4、、进样接口、离子源、质量分析器、检测器、计算机控制及数据处理系统、真空系统等构成。,3.1 进样系统,高效液相色谱一质谱联用仪的进样方式有直接进样和柱后分离进样两种方式，将试样导入质谱仪。,3.2 离子源,样品进行质谱检测时，需将中性样品(不带电性)变成带正电荷的离子或带负电荷的离子才能检测，在质谱仪中实现此过程的装置叫离子源。,3.2.1 离子源的分类及特点,从质谱的离子源角度来划分，主要包括：热喷雾( TSP) ，等离子体喷雾( PSP)，粒子束(L INC)，大气压电离(API) 和动态快原子轰击( FAB) 。离子源的性能决定了离子化效率，很大程度上决定了质谱仪的灵敏度。,API 技术

5、是当今质谱界最为活跃的领域，它是一种常压电离技术，不需要真空，减少了许多设备，使用方便，因而近年来得到了迅速的发展。 API 主要包括电喷雾离子化( ESI)，气动辅助电喷雾即离子喷雾离子化( ISI) 和大气压化学离子化(APCI) 3 种模式。它们的共同点是样品的离子化在处于大气压下的离子化室内完成，离子化效率高，大大增强了分析的灵敏度和稳定性。,（1）电喷雾离子化(ESl)工作原理,样品溶液从毛细管流出时，在电场的作用下喷射形成带电雾状微液滴，在加热条件下，液滴内溶剂蒸发，液滴直径不断变小，使表面电荷密度不断增加，当达到雷利限度，即表面电荷所产生的库仑斥力与液滴的表面张力相等或超过时，液

6、滴即爆裂，从而产生更小的液滴。此过程不断重复，直到液滴变得足够小，表面电场足够强，最终把样品离子从液滴中解吸出来，形成样品离子进入质量分析器被检测。,ESI的适用范围：中等极性或极性有机分子，配合物，蛋白质，多肽，糖蛋白，核酸及其他多聚物。,（2）离子喷雾离子化( ISI)工作原理,与ESI基本相同，但液滴的形成借助气流雾化的帮助。,（3）大气压化学电离(APCI)工作原理,APCI是由ESI派生出来的，它是利用大气压下电晕放电来产生反应离子，这些反应离子再与样品分子发生离子分子反应，从而产生样品分子的带电离子或加合离子被质谱检测。,APCI主要应用于低极性或中等极性小分子分析，要求待测化合物

7、易挥发且有一定的热稳定性。由于极少形成多电荷离子，分析的分子量范围受到质量分析器质量范围的限制。,3.3 质量分析器,将带电离子根据其质荷比进行分离，用于记录各种离子的质量数和丰度。 根据结构的差异，质量分析器包括扇型磁场质量分析器、四极杆质量分析器、离子阱质量分析器、飞行时间质量分析器及傅立叶变换离子回旋共振质量分析器。,3.3.1 四极杆质量分析器,仪器由四根截面为双曲面或圆形的棒状电极组成，两组电极间施加一定的直流电压和频率为射频范围的交流电压。,当离子束进入筒形电极所包围的空间后，离子作横向摆动，在一定的直流电压、交流电压和频率，以及一定的尺寸等条件下，只有某一种（或一定范围）质荷比的

8、离子能够到达收集器并发出信号（这些离子称共振离子），其他离子在运动的过程中撞击在筒形电极上而被“过滤”掉，最后被真空泵抽走（称为非共振离子）。,如果使交流电压的频率不变而连续地改变直流和交流电压的大小（但要保持它们的比例不变）（电压扫描），或保持电压不变而连续地改变交流电压的频率（频率扫描），就可使不同质荷比的离子依次到达收集器（检测器）而得到质谱图。,3.3.2 离子阱质量分析器,离子阱质量分析器（ion trap Mass Analyser）实际是一种三维空间旋转对称四极杆质量分析器。,离子阱由一个双曲线表面的中心环形电极和上下两个端电极间形成一个室腔（阱）。直流电压和高频电压加在环形电极

9、和端盖电极之间，两端电极都处于地电位，在适当条件（环形电极半径、两端电极的距离、直流电压、高频电压）下，由离子源（EI或CI）注入的特定m/z的离子在阱内稳定区，其轨道振幅保持一定大小，并可长时间留在阱内，反之不稳定态离子（未满足特定条件者）振幅很快增长，撞击到电极而消失，质量扫描方式和四极滤质器相似，即在恒定的直流交流比下扫描高频电压以得到质谱图。,3.3.3 飞行时间质谱仪,飞行时间质谱是应用不同的m/ z 离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离。,飞行时间质谱仪特点为： （1）质量分析器既不需要磁场，又不需要电场，只需要直线飘移空间。因此，仪器的机械

10、结构较简单。 （2）扫描速度快，可在10-510-6s时间内观察、记录整段质谱，使此类分析器可用于研究快速反应。 （3）不存在聚焦狭缝，因此灵敏度很高。 （4）测定的质量范围仅决定于飞行时间，可达到几十万u。,3.3.4 傅立叶变换质谱仪,傅立叶变换质谱是近十几年发展的一种新技术，其工作原理与上述几种质量分析器有本质的差别，该技术应用快速傅立叶变换方法将离子的频率信号转换为质谱信号。优点是分辨率高，而且灵敏度随分辨率提高而提高。,3.3.5 质量分析器的主要技术参数,分辨率（Resolution） 灵敏度（Sensitivity） 质量范围（MassRange）,（1） 理论分辨率规定为两个质

11、量为M1和M2的相邻质谱峰刚好分开时仪器的分辨本领，用R表示，即两峰质量的平均值与它们的质量差的比值。,（2）灵敏度是表示质谱峰强度与所需样品量之间关系的量度。 目前有机质谱的灵敏度的测试一般用某一浓度的利血平(Reserpine)，绝对进样量为pg级时所产生质谱信号的信噪比(SN，即峰高与基线宽度之比)表示。 一般来说，有机质谱仪的分辨率和灵敏度是相互制约的。,（3）有机质谱仪的质量范围是指仪器能够准确测定离子的最大质量数。最大质量数的获得与加速电压有直接的联系。加速电压同质荷比mz成反比，降低加速电压，可提高所测的最大质量数，但同时会造成分辨率和灵敏度的降低。,3.4、 串联质量分析器,二

12、级质谱串联是选择一定质量的离子通过一级质谱(MS1) ，使其进入碰撞室，与室内充有的碰撞气体(常用气体为He，Ar ，Xe，CH4 等) 进行碰撞诱导裂解(CID) ，发生离子- 分子碰撞反应，产生子离子，再经第二级质谱(MS2) 进行分析。 串联质量分析器的优势在于不仅能够提供分子量信息，而且可以提供分子结构信息。,MS/ MS 仪主要有3 种数据采集方式:,（1）子离子扫描：选择一定的母离子经CID 活化，MS2 记录产生的子离子。 （2）母离子扫描：选择MS2 中的某一子离子，测定MS1 中的所有母离子。 （3）中性丢失扫描：MS1和MS2 同时扫描，但MS2 与MS1 始终保持质量差m

13、 ，最终的谱图将显示那些来自一级谱图中通过裂解丢失中性碎片(m) 的离子。,3.5 检测器,质谱检测器通常为光电倍增器或电子倍增器，电子倍增器（又称转换打拿极，ConversionDynode）将离子流转化为电流，所采集的信号经放大并转化为数字信号，通计算机处理后得到质谱图。,3.6 真空系统,有机质谱仪的真空系统一般为大抽速机械泵和涡轮分子泵组合构成差分抽气高真空系统，其真空度需达到1.3310-210-5Pa，即10-5 mmHg10-7mmHg。,3.7 数据处理,在液质联用过程中，不同组分的色谱保留时间和由质谱得到其离子的相对强度组成色谱总离子流图，即质量色谱图。 亦可固定某质荷比，对

14、整个色谱流出物进行选择离子检测(Selected lon Monitoring，SIM)，得到选择离子流图。 质谱离子的多少用丰度(Abundance)表示，即具有某质荷比离子的数量。,4、液相色谱-质谱联用仪的维护,4.1 仪器检定,参考国家教育委员会“JJ（教委）0031996有机质谱仪检定规程”进行检定。,4.1.1 技术要求,（1）外观要求 仪器应有规定标志；仪器各部件应完好无损，整个仪器系统的连接应正确无误。 （2） 安装条件 仪器应置于平稳工作台上，仪器室应无剧烈震动，无有机蒸气及腐蚀性气体，附近无强电场和强磁场干扰，室内应有空气交换系统，通风良好，室温应在15C25，相对湿度小于

15、70%，仪器供电电压220V10V,频率50Hz。,4.1.2 检定项目,（1） 真空系统 （2）质量范围 （3）质量稳定度及准确度 （4）分辨率 （5）全扫描MS/MS灵敏度 （6）数据系统 仪器控制软件,4.1.3 检定方法,（1）检查仪器的安装是否符合要求，外观是否完整，联接 是否有误。 （2） 真空度 高真空铝发射真空计显示真空度达到10-5 mmHg10-7mmHg。,4.1.3 检定方法,（3）质量范围及质量数检定 配制一定浓度含有咖啡因、吗啡、高聚物UItramark1621等的校验储备液，安装电喷雾离子源(ESI)，采用流动泵进样，流速3l/min，正离子检测校，收集累计质谱信

16、号，并同其标准图谱进行对比，校准质量数。,4.1.3 检定方法,（4）质量稳定度及准确度 在50%异丙醇/50%水的溶剂中，配制浓度为0.1ng/ul利血平的溶液，采用流动泵进样，流速3l /min，正离子检测模式，分别安装电喷雾离子源(ESI)和大气压化学电离离子源(APCI)，设定相应质谱条件，间隔2小时进样一次，共进样5次，收集累计质谱信号，并同其利血平标准分子离子峰（M+1=609.3）进行对比，达到质量稳定度0.1amu/h。质量准确度0.1amu。,4.1.3 检定方法,（5）分辨率 取质量范围及质量数检定项中校验储备液，安装电喷雾离子源(ESI)，采用流动泵进样，流速3l /mi

17、n，正离子检测模式，收集质谱信号，ZoomScan模式，考察质量范围m/z1822质谱信号，计算分辨率R2000。,4.1.3 检定方法,（6）全扫描MS/MS灵敏度 选用电喷雾离子源或大气压化学电离离子源，在电磁六通阀上安装2u1定量管，连接液相泵，设定质谱条件，正离子检测模式。 取浓度为1pg/l的利血平溶液进样2l，选取50%异丙醇/50%水为流动相，流速350400u1/min，质谱扫描范围165-615，选择全扫描MS/MS模式，优化碰撞能量，采集m/z为609准分子离子峰的二级碎片离子(195、397、448)信号，其信噪比最小为50：1。,4.1.3 检定方法,（7）数据系统(包

18、括计算机检索) 检测仪器控制软件及其它相关软件各项功能能否正确使用。,4.1.4 检定结果处理和检定周期,（1）经检定结果全部项目均符合技术要求者,判为合格,方可使用。若个别指标达不到要求又难以维修,但不影响定性定量结果准确性者,可作为准用品。 （2）新安装或检修后的仪器应按本规程进行裣测。液相色谱离子阱质谱的检定周期为2年。,4.2 仪器使用注意事项,（1）为确证质谱真空系统良好的工作状态，真空泵泵油以及涡轮分子泵油芯需定期更换。 （2）液质联用仪工作温度在1525,相对湿度应小于70%。,4.2 仪器使用注意事项,（3） 液质联用仪应避免振动及阳光直射，其工作环境中应保持一定的通风,避免高

19、浓度的有机蒸气或腐蚀性气体。 （4）液质联用仪应避免各种磁场及高频电场干扰。,4.2 仪器使用注意事项,（5）液质联用仪涉及到仪器中的高电压、有机溶剂及高压钢瓶,实验时应严格执行相关的实验室安全规则。,5、 液相色谱-质谱联用分析方法的建立,5.1 样品的制备,（1）所有样品必须过滤； （2）盐浓度高的样品应预先脱盐处理； （3）未知样品应遵循浓度宁稀勿浓，由低到高的规律； （4）比较复杂的混合物样品一般不宜直接进样。,5.2 色谱条件的确定,根据样品情况选择合适的色谱柱，确定正相或反相的流动相体系、梯度洗脱条件及洗脱速度，若配备紫外检测器可选择适宜的检测波长。,5.2.1流动相的准备,（1）

20、流动相禁止使用非挥发性添加剂、无机酸、金属碱、盐及表面活性剂等试剂。 （2）色谱流动相一般选择色谱纯级试剂。 （3）流动相添加剂一般选择分析纯级甲酸铵、乙酸铵、甲酸、乙酸、氨水、碳酸氢铵，慎用三氟乙酸。 （4）流动相添加剂酸的浓度一般控制在0.1%以下，盐的浓度一般控制在20mM以下。,5.2.2对流速的要求,使用液质联用方式，根据选用离子源的不同，确定液相色谱出口流速以及是否分流进样，并配套相应的各气体参数，使用直接进样时起始流速5ul/min，最大流速不能超过20u1/min(包括冲洗时流速)。,5.3 质谱条件的确定,5.3.1 根据分析目标化合物的性质选择相应的离子源。 5.3.2 根

21、据进样系统及样品的不同，选择相应离子源接口，设定相应的源电压、气化温度、传输线温度、传输线电压及氮气流速。 5.3.3 碰撞气钢瓶出口压力0.2Mpa，氮气钢瓶出口压力0.6MPa。 5.3.4 根据测试要求及样品情况，设定质谱扫描速度、质量范围及扫描条件。,5.4 样品测定,5.4.1 定性分析：确认化合物准分子离子峰，进行二级质谱扫描，推断化合物断裂机理，并结合其他表征及相关信息，推测化合物分子结构。 5.4.2 定量分析 可采用外标法或内标法,二、 液相色谱-质谱联用技术 在医药领域中的应用,1、抗生素药物中有关物质研究,多组分抗生素含有多个组分，且含有相同的母核，差别仅在于取代基的不同

22、，利用LC-MS所得到的有关相对分子质量以及碎片峰的信息，结合紫外光谱和色谱保留行为可快速灵敏的对组分结构进行鉴定。使同时分析多个化合物成为可能,并显示了极大优势。,牛长群等采用HPLC-MS法报道了氨苄西林、阿莫西林中有关物质的检查，分析确定了氨苄西林、阿莫西林中的有关物质。用HPLC-ESI-MS对加速实验样品进行分析，通过解析相关物质的质谱，确定了13 种氨苄西林的相关物质及9 种阿莫西林的相关物质，并定量分析了实际样品中的相关物质，为有效控制氨苄西林及阿莫西林的质量提供了重要依据。,胡敏、胡昌勤应用HPLC-( + ) ESI-MS快速鉴定了头孢硫脒的降解产物，以1%冰醋酸溶液-乙腈(

23、85: 15)为流动相，经C18 柱分离，通过电喷雾串联质谱，正离子检测，获得降解产物的相对分子质量信息和碎片信息，并辅助UV特征和色谱保留特征确定降解产物的结构。结果在所建立的条件下，头孢硫脒及其降解产物得到有效的分离， 2个主要降解产物分别为去乙酰基头孢硫脒和头孢硫脒内酯。,周红华用LC-MS技术分离并鉴定加替沙星注射液光降解产物。实验表明：加替沙星注射液经光照后增加了一光降解杂质峰，该杂质的相对分子质量为335。经推断，加替沙星注射液光降解杂质的结构为：6-氟-8-甲氧基-7-(3-甲基-1-哌嗪基)-1 ,4-二氢-4-氧代-3-喹啉羧酸。加替沙星注射液在避光条件下保存是稳定的。,2、

24、天然药物质量控制中的应用,2.1中药化学成分分析 利用LC-MS技术分析中药化学成分一直是比较热门的领域，包括皂苷类、生物碱类、黄酮类、酚酸、醇苷类等成分的分析研究，为进一步全面了解中药有效成分和药理奠定基础。相关报道见表 1。,表1 国内外期刊关于LC-MS在中药化学成分分析中应用的报道,2.2 中药指纹图谱研究,中药指纹图谱是指基于整体识别中药的观念，以系统的中药化学成分研究为基础，采用一定的分析手段，将反映中药特征的化学成分以图谱的形式描绘出来，主要用于评价中药材以及中药制剂的质量。 在未能将中药复杂成分完全弄清楚的情况下，指纹图谱是总体反映药材及其制剂内在质量和稳定性的可行手段，将其作

25、为中药及其制剂的质量控制方法也已成为国际共识。,丁春光采用HPLC-DAD和HPLC-HRMS技术研究不同贮存年限陈皮的指纹图谱，陈皮甲醇提取物HPLC指纹图谱得到15个共有峰，对其中9个成分进行指认。共有峰多为黄酮类化合物，含量随贮存时间变化较小，其质谱裂解数据具有较强的规律性。,周欣建立蓬莪术药材甲醇提取物的LC-MS指纹图谱评价方法。结果显示四川种植的蓬莪术药材醇提物指纹图谱相似度良好，14个共有峰中经鉴定，46号峰和9号峰分别为姜黄素、脱甲氧基姜黄素、莪术稀醇和莪术酮。,樊夏雷将HPLC-DAD-ESI/MS技术用于不同产地关木通醇提物的指纹图谱研究，建立了含30个共有峰为特征指纹信息

26、的HPLC-DAD-ESI/MS指纹图谱，经对24批样品进行分析，各产地关木通之间相似性良好。,3、药物代谢研究,液质联用技术在分析药物及其在各种复杂生物基质(全血、血浆、尿、胆汁及生物组织) 中的代谢产物时,由于其选择性强、灵敏度高,不仅可以避免复杂、烦琐、耗时的样品前处理工作，而且能分离鉴定难于辨识的痕量药物代谢产物，尤其是串联质谱的应用,通过多反应检测(MRM) ,可以提高分析的专一性,改善信噪比,提高灵敏度,从而快速方便地解决问题。,3.1 药物体内代谢产物的样品的获得和预处理技术,（1）在给药后由血、尿、粪便等体液及排泄物中获得； （2）用含药物的营养液灌流离体脏器与组织切片获得；

27、（3）药液与肝微粒体酶等药物代谢酶温孵获得。,样品的预处理 技术：,（1）液-液萃取(LLE) （2）沉淀蛋白质 （3）固相萃取(SPE),3.2 LC-MS在中药药物代谢研究中的应用,3.2.1 中药代谢产物研究 艾路等采用LC-ESI-MSn技术从具有乌头碱中毒临床表现的患者尿液中检测到5种乌头生物碱代谢产物保存着乌头生物碱的基本结构即乌头烷骨架，可逆证或指示乌头生物碱进入机体，因而可作为乌头碱中毒的指示物，并可在法医学上取代在生物体内代谢迅速难以检测的中毒指标物乌头碱。,刘安昌等将大鼠灌胃给予姜黄素500mg/kg，连续收集016小时累积尿样，采用LC-MS/MS法分析原尿液及-葡萄糖醛

28、酸水解酶酶解后尿样。检测到尿中存在姜黄素原形药及7种代谢产物，即二氢姜黄素、姜黄素的葡萄糖醛酸结合物、六氢姜黄素的葡萄糖醛酸结合物、四氢姜黄素、六氢姜黄素、四氢姜黄素的葡萄糖醛酸结合物、姜黄醇，其中二氢姜黄素为首次报道。,3.2.2中药药代动力学研究,中药及其复方的药物动力学研究主要是研究药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄，用数学模型来定量描述药物在体内的动态过程。它对中药药理学及中医临床医学的发展有着重要意义。相关报道见表 2。,表2 国内外期刊关于LC-MS在中药药代动力学研究中应用的报道,3.3 LC-MS在化学合成药物代谢研究中的应用,将液质联用技术应用于药物代谢研究是该技术在医药领域

29、中应用最广泛、研究论文报道最多的领域。液相与质谱或串联质谱联用显示了独特的优势,代表了药物代谢研究的发展趋势。,3.3.1 化学合成药物代谢产物研究,沈家骢等用LC-MS 鉴定了新型抗镇痛剂SPZ247在家兔体内羟基化及其结合型代谢物。用选择离子监测和多级全扫描质谱(MSn) 分析，确定了药物在体内的代谢途径和代谢物结构。,杜宗敏等研究苯丙哌林在人体内的羟基化代谢过程，收集人单剂量口服60mg苯丙哌林024 h 尿样，经固相萃取后用LC/MSn检测羟基化代谢产物。结果在人尿中发现苯丙哌林的5种羟基化代谢产物和它们与内源性葡糖醛酸和硫酸的结合物，与代谢物对照品的液相色谱和质谱信息比较，确证了其中

30、两种代谢产物的结构分别为4- 羟基苯丙哌林和4 - 羟基苯丙哌林。苯丙哌林的羟基化代谢优先发生在芳环烷氧基对位，5种羟基化代谢产物在尿中主要以葡糖苷酸或硫酸酯结合物形式存在。,3.3.2 化学合成药物药代动力学和生物等效性研究,丁劲松等采用固相微萃取，LC-MS方法测定人血浆中奥曲肽浓度，经分别肌注奥曲肽试验制剂和参比制剂200g,不同时间点采血,研究国产奥曲肽注射剂的人体生物利用度。单剂量im奥曲肽200g后两种制剂的Cmax分别为(1910)gL-1和(1911)gL-1,Tmax分别为(0.5 0 0.15 )h和(0.52 0.20)h；AUC（0-7h）分别为(50 25)hgL-1

31、和(50 25)hgL-1，T1/2分别为(1.5 0.8)h和(1.5 0.8)h，国产奥曲肽注射液的相对生物利用度为101%10%，两种注射剂为生物等效制剂。,4、生物大分子分析,液质联用技术的发展，尤其是电喷雾（ESI）技术的发展，为生物大分子的检测提供了一种强有力的工具。由于ESI是一种很温和的电离方法，特别适合分析强极性、难挥发或热不稳定的化合物；再者，ESI能把许多电荷附着于大分子上，形成多电荷离子，因而利用常规质荷比范围的质谱仪即可实现大分子质量离子的测定。加上HPLC的分离能力，即使是不纯的或是较复杂的混和物，也能得到满意的结果。,4.1 在蛋白质分离和鉴定中的应用,蛋白质组就

32、是基因组所表达的所有蛋白质。目前，用于“海量”蛋白质混合物的高效分离方法主要有二维电泳和高效液相色谱两种方法。而高效液相色谱方法与质谱联用可以克服二维凝胶电泳存在的缺陷。,Cunsolo 等将RPHPLC-ESI-MS用于花粉中引起过敏的蛋白质中二硫键的确证以及所含半胱氨酸氧化态的表征，为蛋白质和多肽中二硫键的研究提供了一个新的方法。,4.2 在多肽类药物研究中的应用,4.2.1多肽的肽图(peptidemap)分析 肽图是能反映多肽一级结构的指纹图谱，不同的多肽具有不同的肽图，因而可用于多肽的定性。 周伟等用HPLC-MS为乙型肝炎治疗性多肽PA44的HPLC胰蛋白酶肽图谱的质量研究奠定了基

33、础。,4.2.2 多肽的氨基酸序列分析,多肽类药物的氨基酸序列的测定既是药理学研究的需要，也是基因工程药物生产的基础。既往进行肽一级结构分析主要通过HPLC纯化，技术难度大。而HPLC-MS联用不仅可以快速灵敏的推测出结合肽的一级结构，所需样品量少，仅为pmol级，并且可以对多种肽混合物各组分直接进行一级结构测定，鉴定出多肽侧链中存在的修饰位点及分子中二硫键的定位。,重组人促红细胞生成素是一种基因工程药物，含有165个氨基酸并有4个糖基化位点，彭建和等通过微径HPLC-ESI-MS联用分析了重组人促红细胞生成素的Glu C酶解的肽图谱，确定了含糖肽段的大小，确实了重组人促红细胞生成素的氨基酸序

34、列。,4.3 用于糖的化学结构分析与鉴定,对糖的研究一直是药物研发的主要内容。HPLC-MS联用技术可以快速、直接的给出待测样品各糖组分的相对分子质量，短时间内就能给出寡糖的结构和相对分子质量信息。 同时，HPLC-MS联用还可很好的排除非糖分子离子的干扰，使图谱的解析变得简单而直观。因此，该技术目前已成为糖化学研究者首选的方法之一。,荣绍丰等在研究细菌D-97酶合成海藻糖的过程也运用HPLC-MS联用技术，对细菌D-97酶法合成海藻糖这个较为复杂的生物转化过程中产生的多种结构相似的糖组分进行逐一、直接、快速而精确的分析，从而对D-97酶转化过程及作用机制进行了系统研究。,5、残留物分析,残留物分析主要包括农药、重金属、毒性物质和非法掺杂物的检测等。近来随着先进仪器和方法的引入以及研究水平的提高，使得药物及药物制剂中农残、重金属和一些有毒性的物质都日益受到重视。,5.1 农药残留量分析,潘元海等用反相色谱短柱实现了6种有机磷农药（乙酰甲胺磷、甲基对硫磷、杀螟硫磷、喹硫磷、二嗪农、辛硫磷）的HPLC-APCI-MS快速分析，二嗪农和喹硫磷的检出限可达0.09ng和0.1ng。,5.2 残留药物成分的鉴定分析,吉永亮等采用高效液相色谱-电喷雾-串联四极杆质谱法，以甲醇-乙腈-0.1%甲酸(202060)为流动相建立了测定蜂蜜中残留氯霉素的方法，加入同