2015 12基因工程的基本操作程序（上课用）

1、1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,基因工程基本操作的四个步骤,C,1基因工程的正确操作步骤是( ) 使目的基因与载体相结合 将目的基因导入受体细胞 验证目的基因的表达是否符合特定性状要求 提取目的基因 A B C D,C,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中直接获取,1.基因文库：概念见P9,2

2、.种类,基因组文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因 如：cDNA文库,提取某种生物的全部DNA,限制酶,一定大小的DNA片段,与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,P 10,基因组文库,某种生物的单链mRNA,单链cDNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,P 10,cDNA文库,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较P10,1.概念：,3.原理：,(二)利用PCR技术扩增目的基因,4.前提：,2.目的：,6.过程：,7.特点：,阅读 P 10 最后两段,思考,5. 条件：,1.PCR含义：

3、P10,以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,DNA复制（碱基互补配对原则）,模板DNA、原料(四种脱氧核苷酸)、能量、酶（热稳定DNA聚合酶）、引物、温度,指数,2n,有一段已知目的基因的核苷酸序列,大量扩增目的基因,5. 条件：,(二)利用PCR技术扩增目的基因,过程 P10,高温变性（解旋为单链）,低温退火（引物与单链互补结合）,适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）,PCR过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Ta

4、q酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR动画,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,2下列属于PCR技术的条件的是（ ） 引物 目的基因所在的DNA片段 游离的4种脱氧核苷酸 游离的4种核糖核苷酸 DNA连接酶 DNA聚合酶 DNA限制性核酸内切酶 A B C D,B,3下列有关PCR技术的叙述正确的是 A.作为模板的DNA序列必须不断的加进每一次的扩增当中 B.作为引物的脱氧核

5、苷酸序列必须不断的加进每一次的扩增当中 C.反应需要的DNA聚合酶必须不断的加进反应当中 D.反应需要的DNA连接酶必须不断的加进反应当中,B,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),逆转录酶,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：,3、人工合成的目的基因,小结,（二）、获取目的基因的方法,D,4.下列获取目的基因的方法中需要模

6、板的是( ) 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成DNA A B C D,D,质粒,目的基因,限制酶,二、基因表达载体的构建核心,质粒,DNA分子,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA 连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种 限制酶,构建过程,构建目的（基因表达载体功能） ？,起初科学家把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫

7、基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料:,它们各自的作用是什么?,基因表达载体的组成,1.用_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,(二)基因表达载体的构建,4.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因,B,5、目的基因与运载体结合所需的条件是( ) 同一种限制酶 具有标记基因的质粒

8、RNA聚合酶 目的基因 DNA连接酶 四种脱氧核苷酸 ATP A. B. C. D.,D,载体与表达载体的区别： 二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：限制酶和DNA连接酶，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必须以表达载体的方式携带进去。,小结,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入植物细胞,将目的基因导入动物细胞,将目的基因导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射技术,Ca2+ 处理法 （感

9、受态细胞）,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,适用对象：双子叶植物、裸子植物,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点 P12,（2）基因枪法单子叶植物 （3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 受体细胞：受精卵 程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞

10、、遗传物质少 方法： Ca2+处理法,Ca2+处理细胞 细胞壁通透性增大 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,DNA分子 杂交技术,是否显示 出杂交带,目的基因是否 转录出mRNA,分子杂交技术（DNA和mRNA）,同上,目的基因是否 翻译出蛋白质,抗原 抗体杂交,同上,包括做抗虫、抗病的接种实验，以确定是否有抗性 以及抗性的程度；基因工程产品与天然产品的功能 进行活性比较，以确定功能是否相同,目的基因成功表达的标志：通过转录翻译合成蛋白质,归纳步骤,8.利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需要

11、的产品。下列选项中能说明目的基因完成了在受体细胞中表达的是 （ ） A.棉花二倍体细胞中检测到细菌的抗虫基因 B.大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA C.山羊乳腺细胞中检测到人生长激素DNA序列 D.酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白,D,表达,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,1.(08上海生物卷) 以重组DNA技术为核心的基因工程正在改变着人类的生活。请回答下列问题。 （1）

12、获得目的基因的方法包括 和 。 （2）切割和连接DNA分子所使用的酶分别 是 和 。,从生物材料中直接分离,人工的方法合成,限制酶,DNA连接酶,（3）运送目的基因进入受体细胞的载体一般选用病毒或 ，后者的形状呈 。 （4）由于重组DNA分子成功导入受体细胞的效率 ，所以在转化后通常需要进行 操作 （5）将人胰岛素基因分别导入大肠杆菌与酵母菌，从两者中生产的胰岛素在功能和 序列上是相同的。,氨基酸,筛选,低,环状,质粒,2 .转基因植物油是由转基因植物通过压榨或浸出法加工制得的，因其出油率高而被广泛采用。我国是植物油消费大国，每年都从国外进口大量的转基因植物油。 (1)在培育转基因油料植物的过

13、程中，基因操作需要的工具酶是 _。在基因表达载体中，目的基因 的首端必须含有_，它是_识别和结合位点。 (2)请写出一种将目的基因导入油料植物细胞可以采用的方法： _。若受体细胞为植物体细胞，可采用_技术获得转基因植物体，该技术所依据的原理是_。,限制酶和DNA连接酶,启动子,RNA聚合酶,农杆菌转化(或基因枪、花粉管通道)法,植物组织培养,植物细胞的全能性,(3)若要检测(2)中获得的植物细胞染色体上是否含有目的基因，可采用_技术。而想要得知上述植物是否真的出油率高，应如何做？_。,DNA分子杂交,将该植物制出的植物油与同等质量的非转基因植物制出的植物油称重比较,3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,a,a,4不属于获得目的基因的方法有（ ） A构建基因文库从基因文库中获取 B人工合成 CPCR技术大量获得 D利用农杆菌转化法获得,D,知识点一：1.原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,启动子：位于基因首端一段能与RNA聚合酶结合并能