第五章 核酸化学

1、核酸化学,核酸化学,核酸的种类和分布,1,核酸的结构,2,核酸的物理化学性质,3,现代核酸技术(分离、纯化技术),4,核酸化学,1.核酸的种类和分布,核酸概述,1.在1869年，瑞士外科医生F. Mischer从细胞核中分离得到一种含磷丰富的酸性物质，称为“核素” ，即现在被称为核酸的物质。 2.1889年命名为“核酸”，即 细胞核内的酸性物质。 3.1909年，A.Kossel发现核酸的四种碱基，组成单位(核苷酸)； P.A.Levene研究了核糖、脱氧核糖 4.1939年，E. Knapp等第一次用实验方法证实核酸是生命遗传的基础物质。 5.1944年，Oswald Avery提出遗传的物

2、质基础是DNA(肺炎双球菌) 6.1951年，在X射线衍射技术支持下结构澄清。 7.1953年，Waston & Click 提出DNA的双螺旋模型。,核酸是存在于细胞中的一类大分子酸性物质，包括 : 以核苷酸为基本单位所组成的多核苷酸长链。 DNA则是遗传信息的载体 RNA主要参与遗传信息的表达,脱氧核糖核酸（DNA）,核糖核酸（RNA）,1.1 核酸的分类,核酸,脱氧核糖核酸（DNA） Deoxyribonucleic Acid,核糖核酸（RNA） Ribonucleic Acid,按照组成核酸分子的戊糖的结构不同分为：,DNA分子含有生物物种的所有遗传信息，分子量一般都很大。 DNA为双

3、链分子，其中大多数是链状结构大分子，也有少部分呈环状结构(细菌的DNA)。,脱氧核糖核酸（DNA）,核糖核酸（RNA）,RNA主要是负责DNA遗传信息的翻译和表达，分子量要比DNA小得多。 RNA为单链分子。 作为遗传物质,H1N1,RNA分类,RNA,mRNA,tRNA,rRNA,其他RNA snRNA snoRNA scRNA antiRNA,约占总RNA的5% 不同细胞的mRNA的链长和分子量差异很大 它的功能是将DNA的遗传信息传递到蛋白质合成工厂-核糖体,约占总RNA的1015% 它在蛋白质生物合成中起翻译氨基酸信息，并将相应的氨基酸转运到核糖体的作用 已知每一个氨基酸至少有一个相应

4、的tRNA tRNA分子的大小很相似，链长一般在73-90个核苷酸之间,约占全部RNA的80% 是核糖体的主要组成部分 rRNA 的功能与蛋白质生物合成相关,mRNA,tRNA,rRNA,1.2 证明DNA是主要遗传物质的证据,1944年，O. Avery 肺炎双球菌转化实验 1952年，A.D Hershey和M. Chase 噬菌体感染实验,肺炎双球菌转化实验,活的滑面病毒,加热杀死的滑面病毒,活的粗面病毒,肺炎双球菌转化实验,加热杀死的滑面病毒,活的粗面病毒,32P-DNA,35S-蛋白质,噬菌体感染实验,1.3 核酸的化学组成,1.3.1 碱基,RNA,DNA,嘧啶环（Py）,嘌呤环（

5、Pu）,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,碱基的 酮式-烯醇式，酰胺-亚氨醇式 互变异构,胺式-亚胺式,互变异构：,酮式-烯醇式 G U T,胺式-亚胺式 A C,U,C,1.3.2 戊糖,-D-呋喃核糖 (in RNA),-D- 2-呋喃脱氧核糖 (in DNA),1.3.3 稀有碱基,都是基本碱基的化学修饰型，如： 嘌呤：次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、N2、N2-二甲基鸟嘌呤 嘧啶：5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、二氢尿嘧啶 4-巯尿嘧啶,（I）,（m1I）,碱基,修饰,稀有碱基,基本AA,不常见的蛋白AA,鸟嘌呤,次黄嘌呤（I）,1-甲基次黄嘌呤（m1I）,稀

6、有碱基(修饰流程示例),CH3,5-甲基胞嘧啶,6-甲氨基腺嘌呤,N2、N2-二甲基鸟嘌呤,5-羟甲基胞嘧啶,稀有碱基(修饰碱基),m22,2G,m5C,hm5C,CH3,7-甲基鸟嘌呤,4-硫尿嘧啶,稀有碱基(修饰碱基),s4U,m7G,1.3.4 核苷,核苷:是由戊糖与含氮碱基经脱水缩合而生成的苷类化合物 在大多数情况下，核苷是由核糖或脱氧核糖的C1 -苷羟基与嘧啶碱N1或嘌呤碱N9进行缩合(N-C键)，故生成的化学键称为 -N-糖苷键,碱基被修饰,核糖的C2位置被甲基化,碱基与核糖链接方式不同（假尿嘧啶 ）,修饰核苷,核苷,腺苷(AR) 脱氧胞苷(dCR),-1,N9-糖苷键 -1,N1

7、-糖苷键,假尿苷（） -1,C5-糖苷键,C1,N9,C1,N3或N1,5,6,4,3,2,1,RNA中四种,DNA中四种,1.3.5 核苷酸的结构与命名,核苷酸:是由核苷与磷酸经脱水缩合后生成的磷酸酯类化合物，包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两大类。 由于与磷酸基缩合的位置不同而分别生成2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸。最常见者为5-核苷酸（5 常被省略）。,核糖核苷酸：2-核苷酸、3-核苷酸和5-核苷酸,脱氧核糖核苷酸： 3-核苷酸和5-核苷酸,核苷酸的分子结构,腺嘌呤核苷酸AMP,鸟嘌呤核苷酸GMP,胞嘧啶核苷酸CMP,尿嘧啶核苷酸UMP,次黄嘌呤核苷酸IMP,5-核苷酸：又可按其在5位

8、缩合的磷酸基的多少，分为一磷酸核苷酸（NMP）、二磷酸核苷酸(NDP)和三磷酸核苷酸(NTP)。,AMP ADP ATP,1.3.6 核苷酸的衍生物,（1）ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),1.ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物 2.ATP含有两个高能磷酸键。ATP水解时, 可以释放出大量自由能 3.ATP是生物体内最重要的能量转换中间体。用于推动生物体内各种需能的生化反应 4.ATP也是一种很好的磷酰化剂。磷酰化反应的底物可以是普通的有机分子，也可以是酶。磷酰化的底物分子具有较高的能量（活化分子），是许多生物化学反应的激活步骤,（2）GTP (鸟嘌呤核糖核苷三磷酸),GTP是

9、生物体内游离存在的另一种重要的核苷酸衍生物。它具有ATP 类似的结构, 也是一种高能化合物。 GTP主要是作为蛋白质合成中磷酰基供体。在许多情况下, ATP 和 GTP 可以相互转换。,（3）环核苷酸的分子结构,环一磷酸腺苷 环一磷酸鸟苷,一分子的核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。,2.核酸的结构,2.1 核酸的一级结构,2.1.1 多核苷酸链,核酸就是由许多核苷酸单位通过3,5-磷酸二酯键连接起来形成的不含侧链的长链状化合物。 核酸具有方向性的长链状化合物，多核苷酸链的两端，一端称为5-端，另一端称为3-端。,碱基编

10、号：1，2，3，4. 核糖编号：1，2，3，4，5,在多聚核苷酸中，两个核苷酸之间形成的磷酸二酯键通常称为3,5-磷酸二酯键 多聚核苷酸链一端的C5带有一个自由磷酸基，称为5-磷酸端（常用5-P表示）；另一端C3带有自由的羟基，称为3-羟基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是 35,多核苷酸链的特点：,5-AGTCCATG-3 反向 AGTCCATG 正向 GTACCTGA,2.1.2 核酸一级结构的表示方法,5-AGCT-3,1. 直接用碱基表示（字母式缩写）,2. 线条式缩写,DNA双螺旋结构是DNA二级结构的一种重要形式，它

11、是Watson和Crick两位科学家于1953年提出来的一种结构模型。,2.2 DNA的结构,P130,二级结构,DNA,RNA,目前已知DNA双螺旋结构可分为A、B、C、D及Z型等数种，除 Z型为左手双螺旋外，其余均为右手双螺旋,DNA结构的多态性,类型 结晶状态 螺距 堆积距离 每螺旋碱基数目 碱基夹角,A 75%相对湿度，钠盐 2.8nm 0.25nm 11 32.7,B 92%相对湿度，钠盐 3.4nm 0.34nm 10 36,C 60%相对湿度，钠盐 3.1nm 0.33nm 9.3 38,类型 旋转方向 直径 螺距 堆积距离 每螺旋碱基数目 碱基夹角,Z 左旋 1.84nm 4.

12、5nm 0.38nm 12 -60,B 右旋 2.37nm 3.4nm 0.34nm 10 36,P136,不同DNA的碱基摩尔比,DNA来源 A T G C m5C,AC,C+T+m5C,AC+m5C,G+T,T,A,G,C+m5C,小牛胸腺 28.2 27.8 21.5 21.2 1.3 0.99 1.01 1.01 0.96,大白鼠骨髓 28.6 28.4 21.4 20.4 1.1 1.00 1.00 1.00 1.00,小麦胚 27.3 27.1 22.7 16.8 6.0 1.00 1.00 1.01 1.00,酵母 31.3 32.9 18.7 17.1 1.00 0.94 0.

13、95 1.09,噬菌体T5 30.3 30.8 19.5 19.5 0.99 0.97 0.98 1.00,人结核分支杆菌15.1 14.6 34.9 35.4 1.00 1.02 1.03 0.99,噬菌体X174 24.3 32.3 24.5 18.2,P134,2.2.1 DNA的一级结构,DNA，脱氧核糖核酸，作为遗传物质的载体，相对分子量较大,大肠杆菌（E.coil）DNA的分子量为2.8109，含3.8106bp,DNA大多为线形分子，少数病毒（如噬菌体X174、M13）及高等 植物的线粒体DNA，叶绿体DNA都是环形DNA,多数DNA是双链的，少数DNA是单链的,DNA的一级结构

14、：构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序而 形成的线性结构，即组成DNA的核苷酸的排列顺序。,基因：DNA上具有独立功能的基本核苷酸序列单位,基因组：一个DNA分子上的全套基因，某一物种的所有基因总和,2.2.2 DNA的一级结构的测定,1. 末端终止法,Fredrick Sanger,利用2 3-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）作为 DNA合成链延伸的抑制剂，产生长短不一的并具有特定末端的 DNA片段。,1975年， Fredrick Sanger,利用DNA聚合酶，建立“加减法”， 测定了第一个DNA全序列，即：噬菌体X174（5386bp）,2,3-ddNTP,将待测DNA加热变性处理成

15、单链，作为合成的模板，并加入与 其5-端互补的短链(RNA引物)作为引物（引物5端用32P标记）,将样品分为4份，每一份加入4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）以及 一种双脱氧核苷三磷酸（4份样品中分别加入ddATP ddGTP ddCTP ddTTP），并加入DNA聚合酶，催化合成一系列不同长 度的片段，每个片段在加入的那种双脱氧核苷三磷酸处终止。,合成产物在同一凝胶上进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。在电泳中每 相差一个核苷酸都可以分离成不同的区带，最后进行放射显影， 从电泳图谱上可直接读出其序列。,2,3-ddNTP,3-ACGTCTGAT-5,TGCddA,TGCAGddA,TGCAGACTddA,T

16、ddG,TGCAddG,TGddC,TGCAGAddC,ddT,TGCAGACddT,5-引物-OH-TGCAGACTA-3,1,2,3,4,5,6,7,8,9,待测链,合成链,自动测序仪,A T C A G A C G T,5,3,A G C T,TGCddA,TGCAGddA,TGCAGACTddA,TddG,TGCAddG,TGddC,TGCAGAddC,ddT,TGCAGACddT,3-ACGTCTGAT-5,5-引物-OH-TGCAGACTA-3,待测链,合成链,2. 化学法,美国哈佛大学Allan Maxam Walter Gilbert利用硫酸二甲酯和 肼两种试剂，特异修饰碱基，

17、产生一套长短不一的片段，然后进 行聚丙烯酰胺凝胶电泳及放射显影，从电泳图谱上读出序列。,CH3OSOCH3,|,|,O,O,硫酸二甲酯,肼,硫酸二甲酯可特异修饰G和A（甲基化），但修饰后的G比A其糖 苷键更容易断裂。用甲酸代替硫酸二甲酯，则两种碱基都断裂； 肼断裂嘧啶核苷酸，但有NaCl存在时，肼专一断裂C，无NaCl, 则C和T均断裂。所以不同条件下，可产生以4种碱基为末端的片 段。,DNA,甲酸 G A碱基断裂,硫酸二甲酯 G碱基断裂,肼NaCl C碱裂断裂,肼 C T碱基断裂, 用多核苷酸激酶对待测DNA片段进行末端32P标记，使其带放 射性, 将样品分成4份，分别加入上述化学试剂(甲酸

18、、硫酸二甲酯、 肼NaCl、肼)，反应后产生一套片段, 反应后将其在同一块凝胶上电泳，电泳完毕后进行放射显影， 从电泳图上直接读出序列,化学法DNA测序流程,硫酸二甲酯,甲酸,肼,肼+NaCl,真核细胞DNA一级结构的特点,真核细胞染色质由DNA、组蛋白、非组蛋白、RNA等组成。,特点：,1. 重复序列较多。根据重复出现的程度不同，分为：,(1) 高度重复序列,(2) 中度重复序列,(3) 单一序列,(1) 高度重复序列,重复序列较短，含5-100bp 重复次数多，高达几百万次（106-107） 序列中G和C含量高于其他部位，也称为 卫星DNA,Satellite DNA,(2) 中度重复序列

19、,(3) 单一序列（单拷贝序列）,重复单位较长，一般为100-300bp 重复单位次数从几百到几万不等 组蛋白基因、rRNA基因、tRNA基因都是中度重复序列 其中另一类：可移动的片段，称为逆转座子，和进化有关系,真核细胞中，除了组蛋白外的其他蛋白质都是由DNA上的 单一序列据定的。 单一序列大小不等，每一个序列代表一个蛋白质或一个蛋白 质系列，也称为一个 结构基因,2. 间隔序列和插入序列,在DNA分子中，除了编码蛋白质和RNA的基因序列外，还有许多 序列不编码任何蛋白质和RNA：,存在于基因和基因之间的序列称为 间隔序列,存在于基因内的序列称为，插入序列,一般，把基因内的插入序列，称为内含

20、子，把编码蛋白质 部分的序列，称为外显子,内含子,外显子,3. 回文序列,DNA分子中，脱氧核苷酸的排列顺序两条链中顺读与倒读意义一 样，绕轴旋转180度正好重合，称为回文序列。,5 -T - A - G - C - T - A - T - A - G - C - T - A - 3,3 -A - T - C - G - A - T - A - T - C - G - A - T - 5,旋转轴,2.2.2 DNA双螺旋结构的要点,（1）DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，

21、而另一条链的方向为35。,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成垂直方向。,2.2.1 DNA双螺旋结构的要点,（3）螺旋横截面的直径约为2.00nm(2.37nm)，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4nm。,2.2.1 DNA双螺旋结构的要点,（4）双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键(碱基堆积力)。 碱基的相互结合具有严格的配对规律，AT，G C结合，这种配对关系，称为碱基互补。A T间形成两个氢键，G C 间三个氢键。 在DNA分子中

22、，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,2.2.1 DNA双螺旋结构的要点,C1-N1,C1-N9,1,2,3,4,5,6,7,8,9,1,2,3,4,5,6,C1-N1,C1-N9,1,2,3,4,5,6,1,2,3,4,5,6,7,8,9,（5） 沿螺旋轴方向观察，配对的碱基并没有完全充满双螺旋的 空间，碱基对的方向性使得碱基对占据的空间不对称，在双螺旋 表面形成两个凹槽，大槽，称为大沟；小槽，称为小沟。,2.2.2 DNA双螺旋的稳定性,DNA双螺旋在生理状态下十分稳定，结构不发生变化。 提问：起稳定作用的有哪些力呢？,答案：疏水作用力（又称碱基堆积力） 氢键 盐键（磷酸OH和组蛋白）,

23、2.2.3 DNA的超螺旋结构（三级结构）,绝大多数原核生物的DNA都是共价封闭的环状双螺旋。如果再进一步盘绕则形成麻花状的超螺旋三级结构。,原核生物DNA的三级结构,DNA超螺旋的变化，一般可用如下的数学式表示：,L T + W 或 W L T,L= 连接数，是DNA双螺旋结构中一条链与另一条链交叉的次数,T缠绕数，双链环绕螺旋轴旋转的周数，即二级结构螺旋数,W超螺旋数,当 LT，DNA双链盘绕过度，产生正超螺旋,当LT，DNA处于松弛状态，产生正常的二级结构,促旋酶 +ATP,LT（正超螺旋）,L 4 时，核酸分子的磷酸基全部 解离呈多阴离子状态，可以把核酸看成是具有较强酸性的多元酸 多阴

24、离子状态的核酸可与金属离子结合成盐，也可与组蛋白结合,3.3 核酸的降解,要研究核酸的结构，常常需要将大分子的核酸降解成小分子片段 工业上，也用此法得到单核苷酸、核苷、碱基等,1. 化学法降解(碱性水解、酸性水解 一般不用 ),（1） 碱性条件下降解,RNA在0.3mol/L NaOH 37下处理16h，RNA完全水解，得到 2核苷酸和3核苷酸（两者比例4：6）。,P122,3-核苷酸,2-核苷酸,同样条件下，碱水解，DNA并没有此反应，借此可将RNA和DNA 分离开来，因DNA的2-位没有羟基，不能形成中间的环氧结构。,DNA RNA,0.3-1mol/L NaOH 37水解16-18h,D

25、NA钠盐 RNA水解成单核苷酸,酸化,DNA沉淀 RNA的单核苷酸溶解而分离,3-核苷酸,2-核苷酸,2.酶法降解,（1）根据对底物的专一性分为,（2）根据切割位点分为,核糖核酸酶(RNase),脱氧核糖核酸酶(DNase),非特异性核酸酶,核酸内切酶,核酸外切酶,普通内切酶,限制性内切酶,（3）根据作用化学键,磷酸二酯酶（脱氧核糖核酸酶类）,磷酸单酯酶（水解磷酸基团）,1. 核糖核酸酶 切断RNA中磷酸二酯键的内切酶,牛胰核糖核酸酶（RNase A）,特异作用于RNA中的嘧啶核苷酸的C-3位磷酸与 其相邻核苷酸C-5位所形成的磷酸二酯键，作用 于RNA后，得到3-嘧啶单核苷酸和嘧啶核苷酸为

26、3-末端的寡核苷酸,核糖核酸酶T1 （RNase T1）,特异地作用于鸟嘌呤核苷酸的C-3位磷酸 与其相邻核苷酸的C-5位所形成的磷酸酯键,G,A,核糖核酸酶U2 （RNase U2）,具有嘌呤特异性的核酸内切酶，作用于嘌呤核苷酸 的C-3位磷酸与其相邻核苷酸的C-5位所形成的磷 酸酯键,多头绒孢菌核糖核酸酶（RNase phy I）,作用于除C以外的其他核苷酸的C-3位磷酸与 其相邻核苷酸的C-5位所形成的磷酸酯键,RNAase A,RNAase A,RNAase T1,RNAase T1,Pu ：嘌呤 Py：嘧啶,RNase U2,RNase phy I,2. 脱氧核糖核酸酶类(磷酸二酯酶

27、),牛胰脱氧核糖核酸酶 （DNase I）,牛脾脱氧核糖核酸酶 （DNase II）,对DNA双链和单链都可以作用，产物是5-末端带磷酸的寡聚 脱氧核苷酸片段，特异性不强，Mg2+激活其活性。,产物是3-末端带磷酸的寡聚脱氧和核苷酸片段， Mg2+抑制其 活性,3. 磷酸单酯键,可切除核酸分子末端磷酸基和核苷酸的磷酸基,4. 核糖外切酶 从核苷酸的一端一个一个切下核苷酸，对DNA与 RNA都起作用,5,OH,B,3,B,B,B,B,B,B,B,牛脾磷酸二酯酶（ 5端外切5得3）,蛇毒磷酸二酯酶（ 3端外切3得5）,3-单核苷酸,5-单核苷酸,3.4 核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧

28、啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，一般在260nm左右有最大吸收峰，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,3.5 核酸的变性、复性与杂交,核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变、甲醛、尿素、酰胺等的存在均可引起核酸的变性。,（1）核酸的变性,加热变性 酸碱变性（pH10） 化学试剂变性(甲醛、甲酰胺、尿素),DNA变性的特征,RNA本身只有局部的双螺旋区，所以变性行为所引起

29、的性质变化没有DNA那样明显。 利用紫外吸收的变化，可以检测核酸变性的情况。 例如:天然状态的DNA在完全变性后，紫外吸收(260 nm)值增加2540%. 而RNA变性后，约增加1.1%。这种现象称为增色效应.,OD260(核苷酸） OD260(变性DNA） OD260(DNA）,由于核酸的变性或降解引起对紫外线吸收增加的效应,称为增色效应,DNA变性的特征,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。通常将引起DNA变性的温度称为DNA融点，用Tm表示。 DNA熔点：DNA变性，其增色效应达到50（即变性达到一半时）时的温度 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值与

30、分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算：,（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44,Tm（G+C）%0.4169.3,DNA的变性温度：加热DNA溶解，使其对260nm紫外光的吸收度突然增加，增加一半时的温度，就是DNA的变性温度（融点温度，Tm）。,Tm的高低与DNA分子中G+C的含量有关，G+C的含量越高，则Tm越高。,（2） DNA复性（退火）,在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。 DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 DNA

31、复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。 分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,通常用Co t1/2 表示复性速度 CoDNA原始浓度 t复性时间,Co t1/2：DNA复性一半所需要的时间与DNA浓度的乘积,4. 核酸及其组分的分离纯化,4.1 核酸分离的一般原则,在细胞内DNA、RNA都以核蛋白的形式存在，且常和其他分子， 如蛋白质、糖类、脂类混杂在一起，核酸分子自身也不稳定，容 易受到外界条件的影响。故，在提取时，应特别注意其提取条件 的控制。,(1)

32、 防止核酸酶的降解，通常可加入核酸酶的抑制剂或去激活剂如 柠檬酸钠、EDTA等。,(2) 防止化学试剂的降解，注意提取时提取化学试剂的作用,(3) 防止物理因素的降解，避免提取时的高温、剧烈动作。在提取 时，应在低温条件下，并避免剧烈搅动。,4.2 DNA的分离纯化,DNA和RNA在生物体内，都和蛋白质结合成相应的蛋白质和核酸 的复合物存在:,DNA+蛋白质DNA蛋白（DNP）,RNA+蛋白质RNA蛋白（RNP）,DNP+RNP都溶解,调节到0.14mol/L盐溶液,RNP溶解，DNA溶解最小，沉淀下来（DNP）,细胞提取物（DNP RNP）,1.0mol/L NaCl溶解,进一步除去DNP中

33、的蛋白质,辛醇-氯仿法： 用含辛醇（或异戊醇）的氯仿溶液震荡核蛋白溶 液，蛋白质发生变性，而处于水相和氯仿相之间，DNA处于 水相，再用酒精沉淀DNA,(2) SDS法 用SDS处理使蛋白质变性，从而分离DNA,(3) 苯酚法：苯酚不仅可以使蛋白质变性，也可以抑制核糖核酸酶 的活性，用苯酚处理后，DNA存在于水相中，而变性DNA存在 于苯酚相中。,得到粗提DNA,粗提DNA的进一步纯化和分离,相对分子量大小不同的线性DNA,相对分子量相同，构象不同的均一DNA,蔗糖密度梯度离心 凝胶电泳,双链DNA和单链DNA,氯化铯密度梯度离心,变性DNA和天然DNA,羟基磷灰石（HA）柱层析或甲基 化白蛋

34、白硅藻土（MAK）柱层析,4.2 RNA的分离纯化,1. 一般采用酚提取法,直接用缓冲溶液饱和的酚溶液处理组织或细胞以除去蛋白质和 DNA。,2. 稀碱或稀盐法,直接用稀碱或稀盐溶液，并结合调节等电点而沉淀的方法,RNA粗提物的纯化，方法多样，如：密度梯度离心、DEAE-纤 维素、DEAE-Aephadex、甲基化蛋白硅藻土等各种柱层析、 亲和层析、免疫法等。,4.3 核酸组分的分离纯化,由核酸通过化学法或酶法降解得到的核苷酸、核苷、碱基等，可 通过离子交换柱层析、凝胶过滤、薄层层析、高压液相层析等方 法分离。,1. 离子交换法分离核酸组分,阳离子交换：主要考虑 环氮（N+H=）的解离，主要参

35、考pKa,尿苷酸不带正电荷，与阳离子交换树脂吸附力很小，首先被洗脱 下来；而嘌呤在聚苯乙烯树脂上的吸附力较嘧啶大3倍，A比C吸 附的更紧，C最后洗脱下来。,U G A C,阴离子交换柱层析,考虑第一磷酸基团和含氮环二者的解离，其洗脱顺序为： C A U G,2. 凝胶过滤法分离核苷酸组分,用于核酸组分分离的凝胶常用的是 交联葡聚糖（Sephadex）,5. 核酸的分析测定及研究方法,5.1 核酸及其组分含量的测定,1. 紫外吸收法 最小范围 4 g/ml,依据核酸中所含碱基具有特征吸收曲线，并且紫外吸收的吸光度 和浓度成正比的性质进行测定,C,MrA260,L,C=核酸或核苷酸的含量 Mr相对

36、分子量 =摩尔吸光系数：1L溶液中所含1mol核酸或核苷酸的吸光度 L比色皿的长度,通常，1 g/ml DNA,A260=0.02, RNA,A260=0.022-0.024,即一个 A 吸光度相当于50g/ml双链DNA, 40 g/ml的单链RNA,2. 定糖法,RNA测定：20-250 g,DNA测定：40-400g,RNA分子中核糖,糠醛,浓盐酸或浓硫酸,3，5-二羟甲苯（地衣酚）,绿色物质,在670-680nm处的吸光度 和浓度成正比,DNA分子中脱氧核糖,浓硫酸或醋酸,二苯胺,蓝色物质,在595-620nm出的吸光度 和浓度成正比,3. 定磷法,元素分析知：纯RNA和DNA中P含量

37、为9.5，因此，测得核酸 中P的含量，在乘以系数（10.5）即得到核酸的含量,核酸样品,强酸消化,无机磷（磷酸磷）原无极磷,钼酸,磷钼酸,抗坏血酸还原,钼蓝,650-660nm处比色测出总磷含量,减去原无机磷的含量,核酸磷的含量,4. 琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭在紫外光照射下能发出荧光，当DNA在琼脂糖凝胶电泳 时，加入溴化乙锭，即插入DNA分子的碱基间形成复合物，使荧 光发射增强几十倍。荧光的强度和DNA的含量呈正比。,5. 核酸的分析测定及研究方法,5.2 核酸纯度的测定,一般用紫外吸收法测定,测定核酸样品在230-320nm处的吸光度，若在320nm处吸光度 比在260nm处的吸光度多百分之几，则表明样品不纯，含有蛋 白质等杂质。,2. 测定增色效应,当A260增色值为35时，表明样品相对较纯,3. 通过测定A260和A280处吸光度来判断纯度,纯DNA：A260/A2801.8 纯RNA：A260/A2802.0 通常用：A260/A2801.8-2.0作为纯度标准,RNA污染 蛋白质和酚污染,5. 核酸的分析测定及研究方法,5.3 DNA凝胶电泳测定DNA相对分子量,DNA片段长度相差在1以上的，长度碱基相差1-50000个碱基 以内的两个DNA分子都可以通过凝胶电泳进行分辨。,聚丙烯酰