分子标记在水稻育种中应用

1、贵州大学作业（论文）题目： 分子标记在水稻中的应用 课程名称： 任课教师姓名： 罗洪发 研究生姓名： 吴健强 学 号： 2010021589 年 级： 2010级 专 业： 作物遗传育种 任课教师评分： 任课教师签名： 2011年 6 月 26 日 分子标记在水稻育种中的应用 专业班级：2010级作物遗传育种 姓名：吴健强 学号：2010021589摘要：分子标记技术给水稻育种提供了新的途径, 与传统育种技术相结合, 可大大提高育种效率, 缩短育种周期。因此,加强分子标记技术在水稻育种上的应用研究具有重要的实践意义。本文简单介绍了几种主要分子标记方法，并且对这几种分子标记的优缺点进行比较，同时

2、也概括综述了分子标记在水稻育种上的一些应用。关键字：分子标记 辅助育种 水稻育种 优缺点 水稻为世界上最重要的粮食作物之一，世界约有 1/ 3 人口以稻米为主食。运用生物技术加快水稻育种进程，使水稻产量取得突破性提高和稻米品质得以显著改善 ,已是育种家和生物技术工作者共同面临的使命。水稻育种家为了培育出优良的水稻品种，通过各种途径对水稻的目标性状进行选择。传统的个体选择方法是对符合育种目标的农艺性状如高产、优质、抗病等进行直接选择，即选择的是个体表现型而不是基因型。一般而言，这种方法对质量性状的选择是有效的；对数量性状的选择，由于存在一因多效、多因一效、调控基因以及修饰基因等的作用，个体的表现

3、型与基因型存在较大差异，因而通过田间表型性状进行个体选择的准确性较差。自20世纪9年代以来,分子标记已被广泛应用于作物遗传育种研究的各个方面:分子遗传图谱的构建、遗传多样性分析与种质鉴定、 重要农艺性状基因定位、分子标记辅助选择育种(MolecularMarker Assisted Selection,MAS)等。利用分子标记进行基因定位和MAS迅速成为作物育种研究的热点,并已发展成为作物分子育种的主要方向。本文简单介绍比较了几种分子标记方法，并综述了其在水稻育种上的一些应用，旨在为水稻育种工作者提供参考,促进分子标记技术在水稻育种中的应用。1、分子标记的概念及其特点分子标记的概念有广义和狭义

4、之分：广义的分子标记是指可遗传并可检测的 DNA序列或蛋白质；狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。每一种标记都有其自身的特点和特定的应用范围，分子标记与形态标记、细胞标记及生化标记等遗传标记相比，具有以下特点：1、 准确性高。直接DNA的形式表现，植物体的各个组织、各生长发育时期均可检测，不受季节及环境因素限制，与基因表达与否无关。2、 数量多。由于基因组DNA的变异极其丰富，分子标记数量几乎是无限的。3、 多态性高。自然界存在许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料。 4、 共显性好。许多分子标记都表现为共显性，能更好地鉴别纯合基因与杂合基因类型。5、

5、对表型无影响。不影响目标性状的表达，与不良性状无必然连锁。2、几种主要分子标记技术比较分子标记自从诞生之日起，一直受到许多学者关注，在历经短短几十年的迅猛发展后，分子标记技术日趋成熟。现有的DNA分子标记技术有几十种基于分子杂交技术的分子标记如限制性长度片段多态性(RFLP)和数目可变串联重复多态性(VNTR)；基于PCR的分子标记主要2大类，其中随机引物的PCR标记主要包括随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物PCR(AP PCR)和DNA扩增指纹印迹(DAF)，特异性引物的 RCR 标记主要包括序列标志位点(STS)、简单重复序列(SSR)、内部简单重复序列(ISSR)、序列特异性扩增

6、区(SCAR)、单引物扩增反应(SPAR)、DNA 单链构象多态性(SSCP)和双脱氧化指纹法(ddF)；基于限制性酶切和RCR技术的分子标记包括扩增片段长度多态性(AFLP)和酶切扩增多态性序列(CAPS)；基于 DNA 芯片技术的分子标记如核苷酸多态性(SNP)。目前，应用较广泛的分子标记技术主要有：RFLP、RAPD、AFLP、SSR和ISSR等。其主要技术原理、基本操作、优缺点和应用：1、 限制性片段多态性（RFLP）： 技术原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA，得到大小不等的DNA片段，产生的DNA数目和各片段长度反映DNA分子上不同酶切位点的分布情况。基

7、本操作：提取DNA限制性内切酶酶切单链转移至杂交膜上标记探针,使探针与杂交膜上的单链 DNA杂交放射自显影显示DNA中含有的与探针的序列同源的限制性片段。主要优缺点：其具有多态性不受环境影响、具有共显性、数量多、标记范围广的优点。但其DNA需要量大、费时费力、周期长、技术复杂、需要同位素等是其缺点。2、 随即扩增多态性DNA（RAPD）：技术原理：利用随机引物（一般为8-10bp）通过PCR反应非定点扩增DNA片段，扩增片段多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。基本操作：提取DNA加入随机引物PCR 扩增凝胶电泳观察拍照主要优缺点：引物短、无种属特异性、DNA需要量少、程序简单、成本低是

8、其优点。其缺点是重复性差和信息量少。3、 扩增片段长度多态性（AFLP）技术原理：利用限制性内切酶水解基因组DNA，产生不同大小的DNA片段，再使酶切片段相连接，作为模板DNA，然后以人工接头的互补连为引物预扩增，最后在添加1-3个选择核苷酸为引物，对模板DNA基因进行选择性扩增，通过凝胶电泳分离检测获得的DNA片段，根据不同的扩增片段长度检测其多态性。基本操作：提取 DNA限制性内切酶酶切连接酶连接限制性片段两端PCR 引物与3接头特异性识别特异性扩增。优缺点：其优点是多态性丰富、标记数量多、DNA需要量少、重复性好、快速、经济简便、信息含量高。其缺点是产生的标记多为显性、技术复杂、对DNA

9、质量要求高、需要同位素等。4、 简单重复序列（SSR）：技术原理：个体核心序列或不同品种的重复次数不同,但此重复序列两侧的DNA序列是保守的，利用与侧连区域互补的引物，通过PCR扩增分析核心序列重复组数的变异性。基本操作：构建基因组DNA文库筛选含有SSR标记的克隆测序阳性克隆 合成引物PCR 扩增电泳分析多态性。其优缺点：其优点是多态性丰富、重复性好、稳定性强。其缺点是成本高、难度大、现有的SSR标记数量有限、突变率高。5、 内部简单重复序列（ISSR）技术原理：用锚定的微卫星DNA为引物，在SSR序列3端或 5端加上2 -4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物引起特定位点退火，导致与锚定

10、引物互补的间隔不大的重复序列间DNA片段进行PCR反应。基本操作：DNA提取ISSR引物筛选ISSR-PCR扩增凝胶电泳观察、拍照。其优缺点：其优点是DNA需要量少、多态性丰富、操作简单、可靠性高、用时少、稳定性高、呈孟德尔式遗传。其缺点是标记大多为显性标记、计算杂合度和父系分析等效果差。3、 分子标记在水稻育种中的应用数十种以Southern杂交PCR 扩增为技术特征的 DNA分子标记技术已陆续建立和应用于生物遗传育种的研究工作中。分子标记技术广泛用于水稻育种工作各个方面, 目前, 分子标记主要应用于遗传多样研究、构建分子标记图谱、品种纯度鉴定、分子标记辅助选择等。3.1 遗传多样性研究 遗

11、传多样性的研究是水稻种质资源研究的主要内容之一。较为全面地了解现有种质资源的遗传多样性,根据品种间遗传距离选配强优势杂交组合及加快回交进程,可以减少育种工作中亲本选配的盲目性,从而提高育种效率。在分子标记出现以前遗传多样性分析主要利用形态性标记和同工酶标记,形态性状易受环境因素的影响,同工酶具有组织和发育阶段的特异性,且可供选择的标记数量有限,同时受环境影响大,数据准确性差,要进行多年、多点试验来减少误差。因此,所需的人力、财力和时间较多。而利用DNA 多态性的分子标记,它直接检测DNA分子结构上的变化,不仅数量大不受环境和发育阶段的影响,且突破了物种之间的生殖障碍,通过利用共同的分子标记分别

12、对不同品种、种或物种之间进行物理或遗传作图,可实现相关品种、种或物种之间的基因组比较分析。因此,利用分子标记技术用一对引物可测出多个多态性,所需人力、财力和时间大大减少。如美国康乃尔大学应用AFLP技术评54份水稻品种的遗传多样性,研究其系统发育和分类,并与同功酶生化标记及RFLP 标记比较,结论一致。马文宾等将31个杂交水稻的亲本进行了分类研究,结果8个恢复系形成一组,与大多数不育系和保持系间存在丰富的遗传多样性。李云海等应用RAPD标记技术分析了生产中正在应用及新育成的24个水稻雄性不育系、3个保持系和3个生产中应用最广的恢复系。表明我国水稻雄性不育系遗传资源比较丰富,但生产中主要应用的不

13、育系遗传背景单一,同时得出应用面积较大的恢复系与雄性不育系分别聚类于不同的类群,且遗传关系较远。唐梅等运用AFLP技术对15个中籼杂交水稻亲本之间的遗传差异进行分析,结果表明,亲本间遗传距离小,恢复系一类的两个亚类(不含明恢63血缘的和全部含明恢63血缘的)的遗传距离无明显差异 ,这表示恢复系的遗传基础较一致,并指出这可能是当前中籼杂交稻品种在产量上徘徊不前、不能明显突破明恢63的重要原因之一。这说明要提高水稻的杂种优势,需丰富亲本的遗传基础,扩大其遗传差异。3.2 构建分子标记图谱高密度分子标记遗传连锁图谱的构建,可为基因定位、物理图谱构建和以图谱为基础的目的基因克隆奠定基础,还可为分子标记

14、辅助选择创造条件。遗传图谱是通过遗传重组交换结果进行连锁分析所得到的基因在染色体上相对位置的排列图。经典的遗传图谱是根据形态、生理和生化标记构建的,由于这些遗传标记在作图群体的两亲本上极为有限,发展很缓慢,且图谱分辨率、饱和度不高,所以应用价值有限。而将分子标记应用于遗传图谱的构建是遗传界的又一重大进展。1988 年,McCOUCH等利用IR34583(籼)/BuluDalam(爪哇)杂交产生的 F2 群体构建了第一张水稻RFLP分子连锁图谱,该图包括135个标记(包括同工酶标记),全长1389cm。日本和美国将构建的分子图谱整合后获得更致密、更精细的图谱。1994年,CAUSSE等构建了包含

15、816个标记的连锁图。陈洪等构建的水稻分子标记图谱有 52 个RAPD标记,覆盖基因组总长度为898.4 cm,标记间的平均间距为 17.3 cm。现在,在RGP网站上,YANO等构建的连锁图上有3267个标记,其中绝大多数为限制性片段长度多态性标记,并且几乎都被转换成了切割长度多态性标记(cleaved amplified poly-morphic sequence,CAPS)。水稻基因组测序计划已经完成,这将为水稻基因组研究提供更多的标记。目前的数据表明, 水稻遗传图谱上的分子标记数已超过6000个,平均间距为 75100 kb,基本覆盖了水稻基因组的所有区域。另外,美国康乃尔大学构建了水

16、稻微卫星标记连锁图, 图上的微卫星标记已达2740多个。据估计,在水稻基因组中大约有5 70010000个微卫星。最近一个包括312个SSR 标记和145个RFLP标记的水稻分子连锁图已在康乃尔大学构建。这些图谱的构建大大加速了基因定位和基于图谱的基因克隆,同时也可对控制数量性状的基因位点进行遗传剖析为构建完整的物理图谱提供了线性框架。3.3 品种纯度鉴定 杂交水稻杂种纯度一般受不育系育性不稳、不同品种间的串粉、机械混杂和人为造假等因素的影响,常规种子质量检测方法(种子形态、石碳酸染色、幼苗形态等)很难快速而可靠地鉴定众多的杂交水稻。同工酶技术所能检测的多态性位点少,而无法鉴定出一些品种间的串

17、粉所导致的杂种不纯;此外种子生长时期的不同常常影响同工酶酶谱的结果,而使同工酶法对鉴定时期要求严格。然而,RAPD技术以能揭示未知基因组DNA序列之间的丰富多态性而广为应用,它不仅能检测单拷贝序列,而且能检测基因组中的重复序列,因此能更好地反映出基因组的特征。所以,利用分子标记的方法鉴定品种纯度比常规的田间表型性状鉴定法快速、准确、简便,成本也不太高,在幼苗甚至种子阶段就可鉴定品种纯度。目前已开始进行分子标记技术(如 RAPD)应用于杂交水稻纯度、真假鉴定的研究,如陈洪等仅用P18一个随机引物就可同时鉴定出不育性育性不稳、大部分水稻品种田间串粉,保持系和大部分水稻品种的机械混杂和人为造假等因素

18、造成的假杂种。3.4 分子标记辅助选择在作物遗传育种中，利用分子标记进行辅助选择(MAS)可以提高选择的准确率与育种效率。近年来，利用分子标记辅助水稻育种已取得重大进展，尤其是关于抗稻瘟病的研究则更多，且关于抗病性基因方面的分子标记辅助选择准确率较高。郑康乐等报道 国际水稻所利用分子标记辅助选择方法成功地获得聚合了3个抗白叶枯病基因和 3 个抗稻瘟病基因的株系。陈红旗等将分子标记辅助选择方法与特异稻瘟病菌株接种鉴定和农艺性状筛选相结合 将3个抗稻瘟病基因 Pi-1、Pi-2和Pi-3导入保持系23B结果表明其对稻瘟病的抗病频率为96.7%。彭琴等2008高结实率多倍体水稻杂种F2代分子标记的分

19、离分析结果表明，水稻植株的杂合度越高，平均结实率就越高。4. 展望分子标记辅助选择技术是现代生物技术在作物遗传改良中应用的一个重要方面。中国利用MAS 在水稻抗白叶枯病品种选育上已取得较大的育种成效，育出一批水稻新品系，其中一些品种（组合）已通过省级或国家级品种审定；在抗稻瘟病育种、稻米品质改良、高产QTL的利用等方面的研究也取得一定的进展。但通过 MAS 育成的水稻新品系或新品种仍很少，究其原因：（1）已经定位的水稻重要农艺性状的主效基因不是很多，可用于MAS的基因有限，许多已定位的基因与其连锁的分子标记的图距太大而无法用于MAS；（2）可用于MAS 便于操作的PCR标记不是很多；（3）基因

20、定位与育种过程相脱节，大多数研究的最初目的只是为了定位目的基因，在实验材料的选择上只考虑研究的方便，而没有考虑与育种材料的结合；因此许多研究最终只是停留在目标基因的定位上，未进一步应用于育种；（4）目前DNA 分子标记的分析鉴定技术要求比较高，成本相对较高。 针对MAS存在的问题，主要应加强以下工作：（1）加强对水稻重要农艺性状基因的定位， 构建更为饱和的分子标记连锁图谱，寻找与目标基因紧密连锁的两侧的分子标记，提高基因型与表现型的一致性；（2）基因定位与育种过程相结合，在选择杂交亲本上应尽量使用与育种直接相关的材料，如目前大面积推广的优良品种，所构建的群体尽可能做到既是遗传研究群体，又是育种

21、群体，缩短基因定位研究与育种应用的距离，实现基因定位与育种同步进行； （3）对于控制数量性状的 QTL 进行精细定位，包括QTL的数目、位置、效应以及QTL之间、 QTL与环境的互作，QTL的一因多效等，充分发掘QTL的信息，选择最佳组合进行分子标记辅助选择；（4）寻找新型的分子标记，简化分子标记技术，降低成本，实现检测过程的自动化、规模化；（5）将分子标记辅助选择技术与常规育种紧密结合起来，利用中国传统水稻育种的丰富经验，加快水稻育种进程，尽快产生较大的经济效益和社会效益。随着水稻基因组研究的迅速发展，特别是PCR的多种方法和技术的不断开发应用，检测技术的简化和实验成本的降低，分子标记辅助选

22、择技术将会在水稻育种中发挥着越来越重要的作用。参考文献：1 李海渤.分子标记辅助选择技术及其在作物育种上的应用.河北职业技术师范学院学报,2002,16(4):68722 夏启中,张明菊.分子标记辅助育种.黄冈职业技术学院学报,2002,4(2):36413 Botstein D,White R L,Skolnick,etal.Construction of a linkage map in man using restriction fragment length polymorphism. Am .J. Human Genet,1980,32:3143314 倪新强,王忠华,夏英秀.分子标

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