常用液相色谱柱原理及使用与维护保养课件

1、使用和维护常用液相色谱仪SOP，1，PPT学习交换，主要内容1，液相色谱仪基本理论知识2，使用和维护常用液相色谱仪3，液相色谱仪常见问题分析和解决方案，2，PPT学习交换，1.2液相色谱仪结构和主要功能液相色谱仪为柱管，压力帽，卡柏柱管：采用不锈钢制成，使用70 kg/cm2以上的柱压力时，可以使用厚壁玻璃或石英管。管内壁需要高光洁度。柱填料使用的填充。压力帽：柱的两端横跨柱的管状端外壁的塑料圆柱帽，中心有小孔，主要由聚四氟乙烯制成，固定屏幕。密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，主要由聚四氟乙烯制成，用于在立柱两端密封管帽和立柱的外壁。3，PPT学习交换，1.3液柱分类和覆盖分类方法可以分类很

2、多键结合类型、用途(分析和准备)、矩阵类型等。1.3.1硅矩阵列(4大类别)目前，分析液相色谱列大部分是硅矩阵列，细分如下：高纯硅柱：以高纯硅烷化硅胶(Silica)为填料，应用范围更广，但只能在PH2.0-7.5，60度以下的条件下使用。另外，由于强极性硅羟基(Si-OH)的二次持有效果强，应用有限，已被粘接相柱取代。反相硅柱：硅烷化硅胶为基体，表面耦合弱极性官能团的固定相。目前常用的是C18(ODS)、C8(MOS)、C4(B)、C6H5(phenyl、苯基)等。用于分离大多数有机化合物，应用最广泛。4，PPT学习交流，正常硅柱：硅烷化硅胶为基质，表面结合极性功能团固定相。NH2(氨基)、

3、CN(氰)、DIOL(二羟基)在分离有机酸、蛋白质等方面，主要是把HILIC单独分类。主要用于分离光学异构体和反相柱不分离的极性较大的物质。离子交换热：将硅烷化硅胶分为基质、磺化交联强阳/负离子集团(磺酸盐/季铵碱)的固定相、再分为强酸性、强碱性、弱酸性、弱碱性等其他规格。用于分离解离性强的有机盐化合物。(请注意：不要跟主要分离无机盐类或某些点离子的离子色谱混淆。)，5，PPT学习交换，1.3.2聚合物基柱聚合物基柱是以聚苯乙烯-二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯、多孔微球蛋白和其他聚合物凝胶为主要填料的柱类型。与硅柱相比，其疏水性更大，pH范围更广(1.0 14.0)，但热效应较低，目前主要用于凝胶渗

4、透色谱(GPC)、凝胶过滤色谱(GFC)和分子排斥色谱(MEC)。主要用于分离蛋白质等大分子化合物。1.3.3其他无机填料柱等仅限于特殊用途，主要使用石墨化碳、氧化铝(Al2O3)、氧化锆(ZrO2)等填料。不需要表面改性，就可以拥有自己的表面，对各种化合物进行强保存。适用于所有pH(除氧化铝外，不能大于12.0)和较高温度(可达100 )。其中，6，PPT学习交流，石墨化碳填料柱可以分离多种化合物，主要用于几何异构分离；氧化铝柱刚度强，色谱仪稳定，分离多种化合物，常用于色谱制造。氧化锆柱比氧化铝柱具有更高的pH应用范围和更高的温度，但其应用还需要进一步研究。生成1.3.4列文件包括品牌、型号

5、、系列编号、购买日期、购买发票、使用记录(使用日期、用户、使用目的、使用)、维护记录(老化时间、老化、故障、失败原因、处理方法、处理结果和图)，7，PPT学习交流，1.3.5常用液相色谱仪的主要应用范围和特性摘要1.3.5.1倒相列，8，PPT学习交流，1.3.5.2正常列，9，PPT学习交流，1.3.5.3聚合物矩阵列(eg .聚苯乙烯列)单独与离子交换器结合时，形成离子交换带，分离酸性化合物(磺酸基)、碱性化合物(季铵组)和药物代谢产物等。特性：在移动1 ph 13时稳定。分离峰形状更好，柱寿命更长。1.3.5.4氧化铝、石墨碳、氧化锆、硅藻土等其他无机物填充柱主要用于色谱的制造。10，P

6、PT学习交换，1.4液柱制备工艺简述了其他品牌柱的制备过程，但可以总结如下(以硅柱为例):硅烷化硅胶制备(四乙基硅烷脱乙基和聚合)Si-OH基暴露(用脱乙基，H代替)海绵状多孔二氧化硅氯-乙基组合)湿混合(添加乙醇等，对每个制造商都有专利保护)装载和填充(机械或手动充电，层间装载、压缩、湿)高压平衡(轴向加压或径向加压，对每个制造商都有专利保护)干燥(此步骤是关键流程步骤，对每个制造商都有专利保护) 12、PPT学习交流，2、常用液柱的使用方法和维护(1)了解柱的标准化使用和维护需求：延长柱寿命，降低柱使用成本，提高分析人员柱的使用和维护水平，确保测试数据的准确性、可靠性和再现性，提高个人在色

7、谱领域的竞争力。 (2)熟悉一些概念。液相色谱仪：指向用于液相色谱分离的圆柱固定相，并结合柱管、帽/套、筛板(过滤器)、填料、接头等，可用于液相色谱分析和制造。柱再生：表示一系列维修措施，以提高柱效率，延长柱的使用寿命，从而引起异常现象和原因。运载溶剂：是指热生产企业通过热厂考试后热饱和的合适溶剂，主要与存储溶剂相同。存储条件：柱生产企业根据不同柱类型和柱填料的制造、粘结、充电、高压定型、净化干燥等工艺条件，特别规定的柱保存前净化饱和处理程序和存储条件(包括净化程序、净化溶剂和保存溶剂、储存温度)。存储溶剂：存储柱并指定溶剂成分和比例的溶液。13，PPT学习交流，(3)了解新栏目正确老化的必要

8、性：新栏目在工厂出货前适当的搬运溶剂饱和，密封，长运输过程周期，支柱床容易干燥，因此在使用新栏目前需要重新饱和和老化。老化方法不准确或时间不足，短使用后热分离度降低，峰变形差异，峰尾等热效果降低容易。根据不同类型的柱，应选择不同的饱和老化方法。2.1普通C8和C18逆相柱(c8c118逆相色谱y柱)(1)制备新鲜超纯和色谱级乙腈或甲醇，冲洗色谱系统，确保仪器系统线路清洁。(新柱子老化之前，绝对不能忽略这个步骤)(2)反转柱子，不附探测器。用水-有机相(90:10-95:5)，用0.3-0.6ml/min流速冲洗20-30min。(3)清洗柱入口的武器碎片和筛孔碎片，使屏幕看起来正常，(3)不连

9、接检测器，将柱正向连接。用水-有机相(90:10-95:5)，用0.3-0.6ml/min流速冲洗20-30min。(目的是冲洗支柱出口的武器碎片和筛孔碎片，使屏幕正常化)，14，PPT学习交流，(4)打开探测器，温度为30 40，水-有机相(90:10 9533605)，0.3(目的是填充饱和柱，从柱中去除空气)(5)水-有机相(10: 90至5336995)，以0.3至0.6ml/min流速冲洗2h以上或120min内的水-有机相(90流动相含有缓冲盐的情况下，不能在柱老化后立即在流动相平衡。首先要用90%以上的水提前平衡30分钟以上。否则缓冲盐会在柱内析出，严重的话，新柱会永久受损。15

10、，PPT学习交换，(7)替换为下一个新系统，并在0.45um过滤器过滤，超声波除气后流动相，根据检测方法，最小平衡1h，基准稳定性后，开始注入检查。(8)由于第一次使用新的热，注射完成后必须立即净化热，使有机溶剂饱和。方法为水-有机相(90:10-953:5)，0.6ml/min流速为1h以上洗涤再水-有机相(90:10-95:5)，1ml/min流速为33如果流动相有缓冲盐，最好用100%的水冲洗1小时以上，然后重复上述净化程序(个别品牌C8或C18列对纯清洗机不耐受的情况除外)。在新栏目中多次使用，恢复正常后，运行净化处理程序，以水-有机相(90:10-95:5)，1ml/min流速清洗1

11、h以上 100%有机溶剂用1ml/min流速洗涤30分钟以上根据柱规格选择储存溶剂(9)净化完成后，第二天不再使用，可以卸下柱，用头螺钉密封，柱管理员可以在防尘环境下保管，记录。16，PPT学习交换，(10)注：老化用有机溶剂建议使用色谱等级甲醇，不同品牌柱应不同对待；水要使用去除离子的超纯水。使用热后存放在库存中，长时间不用再使用时需要饱和。方法以水-有机相(90:10-953:5)，0.6ml/min流速清洗1h以上 100%有机溶剂以1ml/min流速洗涤30分钟以上然后调整水-有机相比率，以获得流动相水相-有机相流动相pH值不能超过柱pH值耐受，过酸容易粘结相变态，过碱要注意硅胶溶解柱

12、床容易倒塌。(11)特别提示：试验溶液中含有一定量的表面活性剂，多次注入后，表面活性剂在筛板和硅胶表面形成表面膜，峰宽，尾拖或分叉。处理方法如下：反向连接柱，不连接探测器，用水-乙腈(90: 10 95:5)，0.6ml/min流速冲洗2h以上使用100%乙腈，用0.6ml/min流速冲洗1h以上接下来正向连接柱，用水，17，PPT学习交流，(12)警告：任何时候都要避免列床干涸，特别是在进样品检测和柱清洗过程中，不要让流化床长时间(30分钟以上)行走。否则，柱会变干，带来很多几乎不排出的气泡，因此，柱床可能部分收缩，或者在中间产生裂纹。严禁在使用和保存时不慎造成的冲击或高处坠落。否则，圆筒形

13、床容易机械损坏，不能再生。2.2正色谱仪目前最常用的正色谱分析方法是氨基柱和氰柱。2.2.1氨基柱(-NH2)氨基柱可用于正负条件，但用于正色谱条件。互相交替使用异丙醇时要小心，这样热储存溶剂和流量才能相互溶解。新购买的氨基柱老化处理和使用基本程序如下：1)在正常条件下使用： n-己乙腈(99: 1)以0.5ml/min的速度冲洗约50倍的柱体积注：氨基柱工厂保存溶剂主要使用正相溶剂，eg. n-，18，根据PPT学习交流，分析，使用与阳极相似的极性的氯仿或二氯甲烷，以相同的速度冲洗，约为热体积的10倍。在等相流动相平衡1小时以上，确认主压力控制在6000Psi以内，防止柱头倒塌。基线稳定后，

14、将进行采样测试。如果要使用的流动相包括缓冲盐类，则在使用流动相平衡之前，切换到没有缓冲盐的相同比例，冲洗热量体积的约10倍，并防止缓冲盐在分析热内析出。分析完成后，用0.5ml/min流速冲洗柱约30倍的体积再用1ml/min流速冲洗柱约10倍的体积再用0.5ml/min流速冲洗柱约10倍的体积再用异丙醇冲洗柱约10倍的体积。使用包含流动相缓冲盐类的分析时，要完成分析，首先要用不含缓冲盐的相同比例的流动相冲洗柱体积约30倍，如上所述。用1ml/min冲洗并保管列手册中规定的正常存储溶剂约10倍的热量。一般使用正己烷乙腈(99: 1)。在正常条件下再次使用时，重复上述 过程，时间适当减少一半左右。19，PPT学习交流，2)必须在反相条件下使用：先用正己烷乙腈(99: 1)为0.5毫升/毫升的流速冲洗柱体积约30倍0.5毫升/毫升的流速依次为0.5毫升(注：要使用的反相流动相包含缓冲盐类，在通过反相流动平衡之前，切换到没有缓冲盐的相同比例流动后，冲洗热量体积的约10倍，防止缓冲盐在分析热内析出。在反相条件下，要特别注意控制pH范围