级开题报告邓岩ppt课件

1、硕士研究生开放报告，5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化和表达的影响，硕士研究生开放报告，导师：姚副教授，时间：2005年8月19日，2月、3月，开放报告，1。基础与研究现状2。实验目的3。技术路线4。主要实验方法。预期成果6。预算7。时间安排03。基础，第1部分，04，5.RASSF1A基因RASSF1A蛋白RASSF1A基因和肿瘤5-氮杂脱氧胞苷的基础、高甲基化，05，长期以来，医学研究者发现癌症患者(普通肺癌患者)的3p染色体存在等位基因缺失，因此推测该区域可能存在一些肿瘤抑制基因。1998年，Sekido等人发现了3p21。3在肺癌和乳腺癌细胞系中具有120kb的最

2、小纯合缺失区。2000年，达曼等人4通过酵母两相杂交筛选，从该区域分离出一个候选的能与DNA修复蛋白(XPA)相互作用的cDNA(互补DNA)。其核苷酸序列的羧基端与小鼠RAS效应蛋白Nore1和Maxp1高度同源，因此被命名为RAS区相关家族1，即RASSF1基因，06，7。RasSF1A基因，RAS基因除了促进细胞生长、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡和衰老外，还有非常重要的功能。RasSF1A基因可能是RAS激活信号转导通路中一个非常重要的负调控基因，对肿瘤的发生、发展和预后具有重要意义。该基因主要有三种不同的转录物，它们共同编码Ras相关同源区(RalGDS/AF26，RA)。这三个转录本是

3、：RASSF1A，RASSF1B，RASSF1C，07，8，RASSF1A，RASSF1A含有外显子1和2，其全长cDNA为1 873 bp，含有340个氨基酸的开放阅读框。编码产物是相对分子量为38 800的蛋白质多肽。其N端与富含半胱氨酸的甘油二酯或佛波酯结合区高度同源，该结合区也被称为蛋白激酶C保守区1 (PKCC1)。它们都在正常组织中表达，但在肺癌、乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾癌和其他肿瘤中有高表达缺失。08，9、RASSF1B、RASSF1B也含有外显子2，但其外显子1不同于转录本A，该转录本全长1 664 bp，可能仅编码Ras同源区(RA)。肿瘤中表达丢失率不高，约为37.13

4、%，09%。10，RASSF1C，RASSF1C外显子从1开始，没有2，全长117 kb，编码一种含270个氨基酸的蛋白质，但不含PKCC1区，相对分子量为32 000。它在正常组织和肿瘤中表达良好。因此，RASSF1A基因可以作为一个重要的候选肿瘤抑制基因进行研究。表达产物是RASSF1A蛋白，10，11，RASSF1A蛋白。作为Ras效应蛋白家族的一员，RASSF1A蛋白通过以GTP依赖性方式结合Ras通路上游的Ras/GTP而被激活，并在抑制细胞生长、促进凋亡和衰老中发挥作用。RASSF1A蛋白的氨基酸序列不仅包含RA区和PKCC1区，还包含一个共济失调毛细血管扩张突变蛋白的磷酸化位点。

5、ATM参与细胞周期调控、有丝分裂中的染色体重组、端粒长度监测和DNA损伤的细胞学反应。RASSF1A蛋白通过激活磷酸化ATM蛋白的PI3K位点抑制肿瘤。11，12，RASSF1A蛋白，1，RASSF1A蛋白通过抑制Ras激活生长效应信号的传递途径起作用；另一个可能的机制是RasSF1A蛋白的失活导致RAS功能失衡，使其主要发挥促进生长的作用。2.RASSF1A蛋白可能是D1(细胞周期蛋白D1。细胞周期蛋白D1对RASSF1A蛋白的活性非常敏感。活化的RASSF1A蛋白能明显抑制细胞周期蛋白D1在细胞中的积累，从而抑制细胞从G1期进入S期，并对细胞增殖产生负调节作用。，12，13，RASSF1A

6、蛋白，3，RASSF1A蛋白在有丝分裂期间分布在微管中，在有丝分裂期间分布在中心体和纺锤体中，并且最终通过细胞分裂周期控制蛋白20，Cdc20)作用于后期促进复合物(APC)，并且抑制APC磷酸化活性，这使得细胞有丝分裂停滞在中期和晚期。13、14，RASSF1A基因甲基化与肿瘤相关。现在很清楚，RASSF1A基因在肺癌和其他癌症中表达失活的机制是由于其启动子区CpG岛的特异性高甲基化。虽然抑癌基因的失活也可能是由突变引起的，但研究结果表明，RASSF1A基因在肺癌中的突变率不到10%，而RASSF1A启动子区在小细胞肺癌和非小细胞肺癌中的高甲基化率分别高达100%和63%，在非恶性肺组织中不

7、发生甲基化。结果表明，用甲基化抑制剂处理不表达RASSF1A蛋白的A549肺癌细胞系，并重新表达RASSF1A蛋白，这可以减少细胞克隆的形成并抑制非粘附细胞的生长。与对照组相比，表达RASSF1A蛋白的裸鼠移植瘤生长明显减慢。14，15、rassf1基因甲基化与肿瘤、rass f1基因不同转录物在肺癌组织中的转录表达及临床意义，如邵康、何杰、程邦昌等。中国肿瘤学杂志，2003，25 (2) :1492153。研究还发现，RASSF1A与淋巴结转移和TNM分期有关。有淋巴结转移或疾病晚期的癌组织中RASSF1A的表达缺失显著高于无淋巴结转移的癌组织(P 0。05)和早期疾病(p 0.01)。15

8、岁，16，5-氮杂脱氧胞苷，脱氧核糖核酸甲基化修饰有多种方式，其中脱氧核糖核酸胞嘧啶碳五甲基转移酶(脱氧核糖核酸甲基化酶)识别脱氧核糖核酸的5。DNA甲基化抑制剂可以逆转甲基化效应，包括防止甲基化CpG突变和重新激活被甲基化抑制的基因。16，17，5-氮杂脱氧胞苷，这些抑制剂及其作用靶点很多。其中，胞苷类似物5氮杂脱氧胞苷的作用机制明确，已进入临床实验阶段，用于白血病治疗。大多数其他化合物仍处于临床前实验阶段。5氮杂胞苷、5氮杂脱氧胞苷和胞苷具有相似的结构，可与脱氧核糖核酸甲基化酶共价结合，降低该酶的生物活性。然而，这些化合物在体内和体外实验中具有细胞毒性和致突变作用。鼻咽癌是一种涉及多种因素

9、的多基因遗传病。然而，关于RASSF1A基因甲基化与鼻咽癌转移关系的文章并不多见。因此，本研究旨在从新的角度反映鼻咽癌的本质。研究状态，18，19，研究现状，卢克伟，邝杰，惠，等。鼻咽癌中RASSF1A启动子高甲基化的高频率。癌症研究，2001，61 3360387723881。方法：分析4例鼻咽癌移植瘤标本、4例鼻咽癌细胞系和21例原发性鼻咽癌标本。研究发现，RASSF1A基因的5CP G岛在移植瘤中的完全甲基化率为100 %(4/4)，在鼻咽癌细胞系中的完全甲基化率为75 %(3/4)，在原发性鼻咽癌中的完全甲基化率为66.17% (6.17%)。19，20。研究现状，在高度甲基化的细胞系

10、和移植肿瘤中发现了RASSF1A基因的高表达缺失。用甲基化抑制剂52氮杂胞苷处理后，RASSF1A基因重新表达并显著抑制细胞生长和增殖。Chow等将野生型RASSF1A基因转染到RASSF1A基因缺失的鼻咽癌细胞C66621中，发现鼻咽癌细胞C66621再表达RASSF1A蛋白可显著减少其细胞克隆形成并抑制非粘附细胞的生长。以上数据表明：1 .RASSF1A基因是鼻咽癌非常重要的候选抑癌基因，启动子区的高甲基化至少是其失活的主要机制之一。(当然，基因缺失的作用不可忽视。)、2。RASSF1A基因的低表达是鼻咽癌晚期转移的一个重要事件，它可能是鼻咽癌转移发生的一个伴随变化，甚至是一个主导因素，2

11、1。第二部分，实验目的，22，实验目的，1。Rassf1a基因的高甲基化和Rassf1a基因的表达在鼻咽癌转移中是否有统计学意义，23，实验目的，2。为了研究5-氮杂脱氧胞苷联合放疗对RASSF1A基因表达的影响，24，第三部分，技术路线，25，裸鼠接种鼻咽癌细胞系，RASSF1A基因甲基化水平及其在鼻咽癌细胞系中的表达，5-氮杂脱氧胞苷治疗，RASSF1A基因甲基化水平的检测，分析和比较它们的差异，RASSF1A基因和蛋白表达，放疗，空白对照，5-氮杂脱氧胞苷联合放疗，鼻咽癌组织，正常组织，RASSF1A蛋白的免疫组织化学检测，26， 主要实验方法(1)甲基化特异性聚合酶链反应(MSP) M

12、SP原理：单链脱氧核糖核酸的胞嘧啶(c)可以被亚硫酸氢盐脱氨基而转化为尿嘧啶。 然而，5-甲基胞嘧啶(5 mC)不能被修饰，并保持为5-甲基胞嘧啶(5 mC)。根据5-甲基胞嘧啶和修饰后的胞嘧啶之间的差异，甲基化和非甲基化DNA的上游引物之间的差异是胞嘧啶(C)到胸腺嘧啶(T)，下游引物是鸟嘌呤(G)到腺嘌呤(A)。在此基础上，设计了甲基化(p16m)等位基因特异性引物和非甲基化(p16u)引物，这两对引物用于扩增同一模板以检测待扩增片段的甲基化状态。扩增片段可用p16m引物扩增，扩增片段可用p16u引物扩增，表明扩增片段未甲基化。如果可以用两对引物扩增，则扩增片段具有部分甲基化。扩增片段位于

13、启动子和第一个外显子，它们的引物序列如表-27所示。28岁。(1)甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)，引物序列bp p16m(上游)5 TTATAGGGGTGGGGCGGATCC 3 150P16m(下游)5 GACCGACCGCGCGACCGTAA 3 150 P 16U(上游)5 TTAGGGGGGGGGGGGGTGATGT 3 151 P 16U(下游)5 caaccccaaaccaaataa 3 151pcr :的反应体积为50l，包括约50ng经亚硫酸钠修饰的模板DNA1*聚合酶链反应缓冲液(16.6毫摩尔/升硫酸铵、67毫摩尔/升三氯丙醇8.8、10毫摩尔/L2-巯基乙醇67毫摩尔

14、/升二氯甲烷)在95热启动15分钟，然后在95循环35次30秒、60循环30秒和72循环30秒，最后在72延伸10次。28，主要实验方法(1)逆转录聚合酶链反应1，从鼻咽组织和鼻咽癌细胞系中提取总核糖核酸，在42下完成2，引物寡(dT)15:正义引物5-tctggggcgtcgcaaa-3；反义产物5-gaacctgatgaagcctgtg-33，内部对照：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH) 4，扩增产物在10%聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并用溴化乙锭(小心，强致瘤剂)5染色。测定RASSF1A和GAPDH基因产物带吸光度的相对比值。该比率表示RASSF1A基因的相对表达强度。-，29，主要实验方法，5氮杂脱氧胞苷5氮杂CdR1.0mol/L(有效浓度分别为0.1，0.5，1.0，2.0，5.0mol/L)，采用免疫组化技术进行放射治疗DT36Gy/18次-，30，第部分，预期结果，31，1鼻咽癌组织高度甲基化，这可与转移能