环介导等温扩增技术

1、环介导等温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌,摘 要:建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法。根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物,然后进行LAMP反应条件的优化、特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较。LAMP方法特异性好,最佳反应温度为61,只对金黄色葡萄球菌进行扩增;灵敏度高,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为89cfu /mL时仍能检出。LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强、灵敏度高、时间短且操作简便,有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法。,简介：金黄色葡萄球菌( S taphy lococcus aureus)是引起食物中毒的主要致病菌之一,也是引起奶牛

2、患乳房炎的重要病原菌 ,在自然界中广泛存在,食品受污染的机会很多。近年来随着抗生素的大量使用,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillinresistantStaphylococcus aureus,MRSA)大量出现。金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因,每年都有肠毒素中毒的报道,已经成为世界性的卫生问题。因此建立快速、简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点。目前,金黄色葡萄球菌的检测方法有很多,主要有分离培养法、琼脂扩散法、免疫学方法、基因芯片法、基因探针法、测试片法、PCR 法等。,环介导恒温扩增技术( loop -mediated isothermal amp

3、 lification, LAMP)是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术,其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,在DNA聚合酶(B st DNA polymerase)的作用下,恒温条件下进行核酸扩增,具有操作简单、特异性强特点。另外通过环引物的添加,大大加快了反应的速度 。国外报道,LAMP被广泛食品等病原菌的检测中,如巴西芽生菌、锥虫病 、沙门氏菌 、虾中的白斑综合症病毒 、志贺氏菌属和大肠杆菌 。本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套LAMP引物,对金黄色葡萄球菌进行检测,优化反应条件,确定检测特异性,对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比。,LAMP的技

4、术原理：,LAMP方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4 种特异引物, 利用一种链置换DNA 聚合酶(BstDNApolymerase)在恒温条件( 60 65 )保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应,直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应。短时间扩增效率可达到109 1010个拷贝。 不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。,材料与方法,材料与仪器 材料： 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 、大肠杆菌( Escherichia coli) 、铜绿假单胞菌( Pseudom onas aeruginosa) 、沙门氏菌( Salm

5、 onella enterica) 、沙门氏菌( Salm onella sp ) 、荧光假单胞菌( Pseudom onas f luorescence ) 、恶臭假单胞菌( Pseudom onas putida ) ，沙门氏菌( Salm onellaHJ- 004) 、志贺菌( Shigella spp ) 、单增李斯特菌( L isteria mmonocytogenes ) 、大肠杆菌( Escherichia coli) ETEC: 44247 ( 6: 15: 16 ) 、EPEC: 44706( 111: 58 ) 、单增李斯特菌( L isteria m onocytoge

6、nes) ，蜡状芽孢杆菌(B acillus cereus ) 、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus ) 、乳酸乳球菌( Lactococcus lactis ) 、嗜热链球菌( S treptococcus therm ophilus KLDS ) 、双歧杆菌(Lactobacillus bif idus KLDS) ，B stDNA 聚合酶(New England B iolab ) 、DNA markerDL2000,仪器：,DYY- 10C型电泳仪 UVP凝胶成像仪,2. 实验方法, DNA模板的制备 煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物,取1mL

7、于EP管中12000 r /min,离心5min 收集菌体, 加入TE - Trinton200L混匀后,于沸水中5min,后12000 r /min 离心5min,取上面50L作为LAMP扩增及PCR扩增反应的模板。另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNA备用。, 引物的设计与合成 根据金黄色葡萄球菌femA基因,应用PrimerExp lorer 3 设计特异引物,包括两条外引物F3、B3,内引物F IP、B IP。 LAMP反应及条件的优化 LAMP反应： 配置反应体系为25L,包括:018mmol /L FIP,018mmol /L B IP, 012mmol /L F3,012mmol

8、 /L B3, 116mmol /L dNTPs, 018mmol /L betaine,4mmol /L MgSO4 , 20mmol /L Tris - HCl ( pH818 ) ,10mmol /L KCl, 10mmol /L (NH4 ) 2 SO4 , 2L DNA 模板,混匀。95, 5min,然后冰浴5min。加入8U BstDNA聚合酶,于65扩增1h, 80灭活10min,产物于210%琼脂糖凝胶电泳检测。,反应条件的优化： 分别改变反应温度、Mg2 +浓度LAMP扩增,电泳观察扩增产物,确定最适的反应条件。 特异性实验： 用建立的LAMP方法扩增大肠杆菌、沙门氏菌等其他

9、18 株菌株,电泳观察扩增产物,验证方法的特异性。 灵敏度实验： 取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液,以10倍比进行稀释至10- 110- 9 ,取各稀释度菌液1mL进行平板计数。同时,取各稀释度菌液1mL,用煮沸法提取DNA,取2L上清液作为模板进行LAMP扩增。,原料乳样品的检测： 采用建立的LAMP方法对从农场采的原料乳进行实际检测,同时采用金黄色葡萄球菌国标GB /T 4789110 - 2003对样品进行检测,两种方法进行对比,确定LAMP直接检测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性、灵敏度。,结果与分析 1.LAMP 方法反应条件的优化 反应温度 B st DNA聚合酶的最适反映温度为65,

10、选择57、59、61、63、65五个不同的反应温度,结果如图1,在同样的反应体系条件下, 61时扩增的效果更好,因此最适LAMP反应温度为61。,图1 反应温度对LAMP反应的影响 M:DL2000 DNA Marker; 1: 57; 2: 59; 3: 61; 4: 63; 5: 65。,图2 Mg2 +浓度对LAMP反应的影响 M:DL2000 DNA Marker; 1: 1mmol/L;2: 2mmol/L; 3: 3mmol/L; 4: 4mmol/L; 5: 5mmol/L。, Mg2 +浓度的影响 选择以不同浓度的Mg2 +梯度来优化LAMP反应体系中的Mg2 + 浓度,结果如

11、图2,同等条件下为6mmol /L时,扩增最为明显,因此本实验LAMP反应体系的Mg2 +浓度为6mmol /L。,图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果,2.特异性 本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等其他菌株进行LAMP扩增反应,结果如图5所示,金黄色葡萄球菌有条带出现,其他菌株未出现条带,表明LAMP扩增反应特异性强。,图3与图4 金黄色葡萄球菌LAMP与PCR检测的灵敏性实验 与PCR检测的灵敏性实验1: 10 - 1 ; 2: 10 - 2 ; 3: 10 - 3 ; 4: 10 - 4 ; 5: 10 - 5 ; 6: 10 - 6 ; 7: 10 - 7

12、; 8: 10 - 8 ; 9: 10 - 9。,3.LAMP 灵敏度实验及PCR检测 当菌液稀释108时, LAMP扩增产物,而当稀释104到PCR 已无扩增条带,说明LAMP扩增灵敏度高于PCR扩增。由平板计数计算表明,金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为89cfu /mL时仍能检出。,4 .对样品的检测结果 采自奶场的125份样品进行了检测。结果表明,LAMP检测出阳性样品81份, GB/T 4789.10- 2003检测出阳性样品84份,LAMP阳性检出率为96.43%。,图5 金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果,M:DL2000 DNA Marker; 1:金黄色葡萄球菌ATCC2592

13、3;2:沙门氏菌CGMCC 111552; 3:沙门氏菌ATCC13067;4:沙门氏菌HJ- 004; 5: ETEC: 44247 (61516) ;6: EPEC: 44706 (11158- ) ; 7:荧光假单胞菌CGMCC 111802;8:恶臭假单胞菌CGMCC111819; 9:铜绿假单胞菌ATCC27853; 10:志贺菌HJ- 14; 11:单增李斯特菌CMCC54002;12:单增李斯特菌HJ - 35; 13:大肠杆菌ATCC25922;14:大肠杆菌O157: H7; 15:蜡样芽孢杆菌KLDS71; 16:瑞士乳酸杆菌KLDS- 8; 17:乳酸乳球菌KLDS- 36;18:嗜热链球菌KLDS; 19:双岐乳杆菌KLDS;N:阴性对照。,结论,金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一,给奶业生产带来严重的影响。LAMP技术根据靶序列上的6 个特定区域设计引物,在具有链置换活性的DNA 聚合酶作用下,恒温进行扩增,环引物的设计大大提高了反应的速度。由于反应过程中,核算合成时,从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结核,产生大量的焦磷酸酶使反应呈现混浊,可