第六、七章 原生质体培养和体细胞杂交.ppt

1、植物组织培养学,第6、7章 原生质体培养与 体细胞杂交,原生质体的分离与纯化 原生质体培养 原生质体融合,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,本章主要内容:,(1)了解原生质体培养的意义； (2)掌握原生质体分离的大致步骤； (3)掌握原生质体培养的方法； (4)掌握原生质体融合的方凑。,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,本章教学目的与要求,原生质体（Protoplast）,含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,微 丝,叶绿体,线粒体,质 膜,细胞核,内质网,微 管,细胞壁,高尔基体,植物细胞模式图,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂

2、交,液 泡,第一节、原生质体分离及纯化,一、原生质体分离,双子叶外植体,胚性细胞,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,多数植物分离原生质体的经典材料-叶肉细胞。,第一节、原生质体分离 及纯化,（一）材料来源,禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。,第一节、原生质体分离 及纯化,（二） 分离方法,机械分离法,酶法分离法,1、机械分离法（Machanical isolation）,第一节、原生质体分离 及纯化,优点： （1）能排除酶的有害影响； 缺点： （1）原生质体的产量低； （2）方法繁琐费力； （3）局限性大,（1）酶的种类,纤维素酶类（Cellulase） 果胶酶类（Pectolyase）

3、半纤维素酶类（Hemicellulase） 崩溃酶 蜗牛酶,2、酶法分离（Enzymatic isolation）,第一节、原生质体分离 及纯化,（2）酶液的配制,第一节、原生质体分离 及纯化,渗透压稳定剂及pH,酶的配比及浓度,（3）分离原生质体,第一节、原生质体分离 及纯化,两步分离法,一步分离法,方法有二：,叶肉原生质体分离提纯,图示原生质体分离过程（以叶片为例）,第一节、原生质体分离 及纯化,过滤、离心,加果胶酶 和纤维素酶,第一节、原生质体分离 及纯化,叶片,愈伤组织,二、 原生质体纯化与活力测定,（一）原生质体纯化,第一节、原生质体分离 及纯化,1、 离心沉淀法,原理：应用原生质体

4、的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤： 第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（500-1000r/min，离心5-6min）。 第三步吸去上清液，洗涤液重新悬浮，再离心沉淀。如此2-3次。 第四步用原生质体培养液洗1次，收集原生质体。,第一节、原生质体分离 及纯化,2、漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 步骤： 第一步：400目网筛过滤。 第二步：离心。 第三步：吸去上清液，洗涤液重悬，离心沉淀。2-3次。 第四步：收集溶液表面原生质体，用培养液洗1次。,第一节、原生质体分离 及纯化,3 、 界面法,25%蔗糖溶液,13%甘露醇溶液,原

5、理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度。,第一节、原生质体分离 及纯化,（二） 原生质体活力测定,1、形态识别：形态上完整，呈圆形，含有饱满的细胞质，颜色鲜艳的即为存活的原生质体。 2、染色识别 1）0.1%酚番红或Evans蓝染色：有活力的不被染色，死亡的被染上色。 2）双醋酸盐荧光素(FDA)染色法：在荧光显微镜下有荧光的即为有活性的原生质体。,第一节、原生质体分离 及纯化,第二节 原生质体培养,一、培养基,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,二、培养方法,第二节、原生质体培养,1、液体浅层培养,第二节、原生质体培养,原生质体悬浮液

6、,1mm厚液体培养基,2x105/ml,2、平板培养,原生质体纯化、离心、稀释后，再与1.4%琼脂或琼脂糖（37C左右）等体积混合成0.7% ，培养于培养皿中。,第二节、原生质体培养,3、双层培养法（固、液培养）,培养皿底部铺一层0.7%琼脂糖的固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养。,第二节、原生质体培养,4、饲养层培养,方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.7%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中。,第二节、原生质体培养,方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。,4

7、、饲养层培养,第二节、原生质体培养,定义：原生质体融合也叫做体细胞杂交，使分离出来的不同亲本的原生质体，在人工控制条件下，相互融合成一体，形成杂种细胞，并进一步发育成杂种植株的技术。,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,第三节、原生质体融合,一、原生质体融合意义,克服杂交不亲合 克服生殖器官败育 克服柑桔多胚,第三节、原生质体融合,二、融合方法,无机盐诱导融合 高pH-高Ca离子 聚乙二醇(PEG)法 PEG结合高钙-高pH诱导法 电融合技术,第三节、原生质体融合,(一)无机盐诱导融合: NaNO3法,1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种。

8、,NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高。,第三节、原生质体融合,1973年：Keller用pH10.5的50 mM CaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合。,优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用。,第三节、原生质体融合,（二）高pH-高Ca离子法,PEG法特点：,融合频率高 可重复性强 诱发融合无特异性 毒性较低,植物+植物 植物+动物 动物+酵母,第三节、原生质体融合,（三）PEG法,PEG法原理,PEG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG

9、将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合。,第三节、原生质体融合,最为常用。 具体做法：在无菌条件下混合双亲原生质体-滴加PEG溶液，摇匀，静置-滴加高钙-高pH溶液，摇匀，静置-滴加原生质体培养液洗涤数次-离心获得原生质体细胞团-筛选-再生杂合细胞,第三节、原生质体融合,（四）PEG结合高钙-高pH诱导法,(五)电融合技术,Senda 1979年首先用此方法实现原生质体融合,第三节、原生质体融合,三、体细胞杂种细胞筛选与鉴定,1互补选择法,第三节、原生质体融合,2、机械分离杂种细胞法,3.

10、双荧光标记选择法,异硫氰酸荧光素（FITC）：绿色 异硫氰酸罗丹明（RITC）：红色,3. 双荧光标记选择法,第三节、原生质体融合,四、体细胞杂种植株的鉴定,形态学鉴定 细胞学观察 DNA内切图谱分析 同工酶分析,第三节、原生质体融合,(1) 原生质体培养的意义：(1)再生植株； (2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。 (2) 原生质体分离方法：机械分离法、酶法分离。 (3)酶的种类及特点 (4)原生质体的纯化方法：离心沉淀法；漂浮法；界面法。 (5)原生质体活力的测定：形态识别；染色识别。,第7章 原生质体培养 与和体细胞杂交,本章小结：,（6）原生质体培养方法：液体浅层培养；平板法培养；悬滴法培养；双层培养法；饲喂层培养 （7）原生质体融合的方法：无机盐