实验六、蚕豆根尖微核检测技术

1、实验6:蚕豆根尖微核试验技术(3小时)(综合设计实验)1。实验目的1。了解染色体畸变的类型、微核试验的原理以及毒理学遗传学在现实生活和工作中的应用范围和意义。学习蚕豆根尖微核试验技术2。实验原理微核(MCN)是真核细胞中的一种异常结构，常由辐射或化学药物引起。在细胞间隙期，微核呈圆形或椭圆形，不含主核，其大小应小于主核的1/3。微核的折射率和细胞化学反应性质与主要核相同。人们普遍认为微核是由有丝分裂后期失去着丝粒的片段产生的，但一些实验也证明了整个染色体或多条染色体也能形成微核。这些片段或染色体在细胞分裂结束时被两个子核排斥，形成第三个核块。已证明微核率与辐射剂量或累积效应呈正相关，与染色体畸

2、变相同。因此，复杂的中期染色体计数可以被简单的间期微核计数所代替。由于大量新化合物的合成、原子能的应用和各种工业废物的排放，人们需要一个高度灵敏和简单的测试系统来监测环境变化。只有真核测试系统才能直接预测诱变物质对人类或其他高等生物的遗传危害。在这方面，微核试验是一种理想的方法。研究表明，微核试验与动植物的符合率可达99%以上。目前，微核试验已广泛应用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、染色体遗传病和癌前诊断。以蚕豆根尖为实验材料的微核试验能准确显示各种处理引起的畸变效应，可用于监测污染程度。三。松滋绿豆种子实验材料之四。实验仪器和药剂：显微镜、计数器、镊子、载玻片、盖玻片、烧杯、瓷盘

3、等。实验药物：6摩尔/升盐酸、甲醇、冰醋酸、品红醋酸、甲基磺酸乙酯处理液：150，200摩尔/升.NaN3(叠氮化钠)处理液：0.5、1.0和1.5毫摩尔/升.三氧化二铬：1.0摩尔/升和2.5摩尔/升污水：五、实验方法1。实验材料的培养蚕豆根尖细胞染色体大，DNA含量高，对诱变因素敏感。松滋青豌豆是从不同蚕豆品种中筛选出的敏感品种。引进该品种后，应注意不要与其他蚕豆品种种植或喷洒农药，以保持该品种的低背景微核值。也可以使用其他蚕豆品种，但必须设置一个控制组。种子成熟后，在阳光下晒干，并储存在4的烘干机或冰箱中备用。2.浸种催芽：将实验蚕豆种子放入盛有蒸馏水的烧杯中，按要求量浸泡2524小时，

4、在此期间至少换水两次。更换后的水应在25预热。种子吸胀后；用纱布将它松散地包裹在白色磁盘中，保持湿度，在25的培养箱中加速发芽12-24小时。当初生根长到2-3毫米时，取发芽好的种子，放入盖有滤纸的磁盘中，在25继续加速发芽。大约36-48小时后，大多数初生根长到大约1-2厘米，根毛发育良好，因此它们可以用于测试。3.处理为每个处理选择6-8个具有良好初生根生长和一致根长的种子，并放入含有待测溶液的培养皿中浸泡根尖。CrO3(1.0和2.5摩尔/升)、NaN3(0.5、1.0和1.5摩尔/升)或环境管理系统(150和200摩尔/升)可用作正因子，另一污水用作待检测物质，自来水用作对照。共有9种

5、处理，根尖处理6 24小时(处理时间取决于实验需要和被测液体的浓度)。4。根尖细胞的恢复培养将处理过的种子用蒸馏水浸泡3次，每次2-3分钟。将洗过的种子放入5.固定根尖细胞并压片(参见根尖压片法)。(1)从根尖顶部切下1cm长的幼根。用卡诺溶液固定24小时。如果固定后没有及时制备，可以将其转化为70%的乙醇，并储存在4的冰箱中备用。6.酸解：从70%乙醇中取出固定的根尖用自来水冲洗3分钟用吸水纸吸干用1 mol/L盐酸放入青霉素瓶中，在600.5水浴中保温解离10分钟。7.染色改性石炭酸品红染色：解离后，将材料水洗3分钟，吸干，取一个根尖的乳白色分生组织，在载玻片上粉碎，然后滴加1 2滴染料溶

6、液，染色10 15分钟，压片。8。压片向染色材料中加入一滴染料溶液，用盖玻片覆盖，用吸水纸覆盖，用带橡胶头的铅笔垂直敲打，或用拇指垂直按压盖玻片(注意不要摩擦盖玻片)，以便材料可以分散和展平，便于观察。9。显微镜检查和微核鉴定标准首先在低倍镜下发现细胞分布均匀、分裂相较多的分生组织区，然后在高倍镜下观察。微核识别标准：(1)小于主核1/3大小并与主核分离的小核。(2)小核的染色与主核相同或略浅。(3)小核呈圆形、椭圆形或不规则形。在每次处理中观察到三个根尖，并且计数和记录每个根尖的1000个细胞中的微核数。6.实验数据的统计处理和污染程度的划分实验数据按以下步骤进行统计分析和处理：1 .计算每

7、个试样(包括对照组)的微核千分率(MCN)。如果控制背景的MCN低于10 ，可以用以下标准进行分析来确定样品的污染程度：MCN低于10，表示基本没有污染；MCN在10 -18 之间，属于轻度污染；MCN在18 -30 之间，属于中度污染；如果MCN高于30，意味着污染严重。也可以用“污染指数”来判断：这种方法可以避免实验条件等因素引起的MCN背景的波动。方法如下：污染指数在0-1.5范围内基本无污染；污染指数为1.5-2范围内的轻度污染；污染指数为2-3.5范围内的中度污染；污染指数高于3.5为严重污染；如果对照背景的MCN大于10 ，可以用t检验(待测样品少时)来检验处理液的致畸作用是否明显，也可以用f检验(待测样品多时)来检验处理间是否有显著差异。注意事项：1。诱发微核的各种处理试剂都有一定的毒性，因此请注意安全使用，防止环境污染。2.当该值在上限和下限内时，它被确定为下一个更高水平的污染。3