生物化学第02章蛋白质化学ppt(浙大版)

1、蛋白质化学,第二章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,蛋白质的生物学重要性,分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1. 蛋白质是生物体重要组成成分,作为生物催化剂（酶） 代谢调节作用 免疫保护作用 物质的转运和存储 运动与支持作用 参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能

2、,3. 氧化供能,蛋白质的分子组成 The Molecular Component of Protein,第一节,组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此，只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：,100克样品中蛋白质的含量 (g %) = 每克样品含氮克数 6.25100,1/16%,蛋白质元素组成的特点,三聚氰胺与结石宝宝、皮革奶的由来？,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有

3、20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,一、蛋白质的基本组成单位氨基酸,（一）氨基酸的结构通式,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,非极性脂肪族氨基酸 极性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,(二)氨基酸可根据侧链结构和理化性质进行分类,极性,1.侧链含烃链的氨基酸属于非极性脂肪族氨基酸,2.侧链有极性但不带电荷的氨基酸是极性中性氨基酸,（甲硫氨酸）,3.侧链含芳香基团的氨基酸是芳香族氨基酸,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 argini

4、ne Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,4. 酸性氨基酸（两个羧基）,5. 碱性氨基酸（两个以上氨基）,目 录,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）,脯氨酸的结构决定它不能参加-螺旋的形成（见后），而-转角结构中常有脯氨酸。 脯氨酸可羟化成羟脯氨酸。, 半胱氨酸,胱氨酸,20种氨基酸如何记？,亚氨基酸（环状）,Pro（脯）,含硫氨基酸,Cys （半胱） 、Met（蛋）,含羟基氨基酸,Tyr（酪） 、Ser （丝）、 Thr（苏）,酸性：Asp（天冬）、 Glu （谷） 碱性：Lys（赖）、Arg（精）、His（组）,甘（Gly）、丙（Ala）、缬（Val

5、）、 亮（Leu）、异亮（Ile）、 天冬酰胺（ Asn ）、谷氨酰胺（ Gln）,三字经,芳香族：Tyr（酪）、Phe（苯）、Trp（色）,营养学上对氨基酸的分类,必需氨基酸：,非必需氨基酸：,动物自身不能合成而必须从食物中获得，缺乏会导致营养不良。,人体有8种:甲硫/蛋、色、缬、异亮、 亮、苯丙、苏、赖。,8种以外,“假设借一两本书来”,修饰氨基酸： 蛋白质合成后通过修饰加工生成的氨基酸。没有相应的编码。如：胱氨酸、羟脯氨酸（Hyp）、羟赖氨酸（Hyl）。 非生蛋白氨基酸： 蛋白质中不存在的氨基酸。如：瓜氨酸、鸟氨酸、同型半胱氨酸，是代谢途径中产生的。,pH=pI,pHpI,pHpI,兼性

6、离子,（三）氨基酸的理化性质,1. 两性解离,两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,2.芳香族氨基酸紫外吸收,色氨酸、酪氨酸,芳香族氨基酸的吸收光谱,280 nm:,多数蛋白含这两种氨基酸残基，测定蛋白溶液280nm光吸收值可快速简便分析蛋白含量。,光密度,3、氨基酸与茚三酮反应生成蓝紫色化合物,氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm处。 由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方法。,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,（一）氨基酸通过肽键连接而形成肽 (pe

7、ptide),二、氨基酸在蛋白质分子中的连接方式,+,甘氨酰甘氨酸,肽键,肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,由十个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,肽链的两个末端,肽键,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,（二）体内存在多种重要的生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, G

8、SH),解毒作用：与毒物或药物结合，消除其毒性作用； 参与氧化还原反应：作为重要的还原剂，参与体内多种氧化还原反应； 保护巯基酶的活性：使巯基酶的活性基团-SH维持还原状态； 维持红细胞膜结构的稳定：消除氧化剂对红细胞膜结构的破坏作用。,谷胱甘肽的生理功用：,体内许多激素属寡肽或多肽,2.多肽类激素及神经肽,种类较多，生理功能各异。 多肽类激素主要见于下丘脑及垂体分泌的激素，如催产素（9肽）、加压素（9肽）、促肾上腺皮质激素（39肽）、促甲状腺素释放激素（3肽）。 神经肽主要与神经信号转导作用相关，包括脑啡肽（5肽）、-内啡肽（31肽）、强啡肽（17肽）等。,三、蛋白质的分类,根据蛋白质组成成

9、分:,根据蛋白质形状:,根据蛋白质的主要功能：,蛋白质的分子结构 The Molecular Structure of Protein,第二节,一级结构 二级结构 三级结构 四级结构,蛋白质结构的四个层次,一、蛋白质的一级结构(primary structure),什么是？,多肽链中从NC端氨基酸的排列顺序。,主要的化学键,肽键,有些蛋白质还包括二硫键,二、蛋白质的二级结构(secondary structure),蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，不涉及氨基酸残基侧链的构象 。,(关键词:主链、肽段、局部),什么是？,二级结构的主要化学键,氢键,二级

10、结构的基本单位,肽单元,（一）二级结构的基础肽单元(peptide unit),对肽单元的说明：,C1和C2为反式(trans)构型,O和H也是反式构型。,肽键键长0.132nm,0.149 nm,0.127 nm ,C1、C、O、N、H、C2 6个原子在同一平面,称为肽键平面。,相邻2肽单元（肽键平面）的相对空间位置,酰胺平面-1,酰胺平面-2,C与羰基Co和N相连的单键能自由旋转，角度为 、 ,该旋转角度决定了相邻2肽单元的相对空间位置。,（二）蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( r

11、andom coil ),外观：右手螺旋（顺）。,-螺旋结构要点：,1、-螺旋 ( -helix ),螺距：3.6个氨基酸、0.54nm。,维持因素：氢键。,R基团的位置：螺旋外侧， R基团影响-螺旋的形成。,肽段折纸状、锯齿状，相对伸展。,-折叠结构要点：,2、-折叠 ( -pleated sheet ),几个肽段顺向平行、反向平行0.70nm。,维持因素：氢键。,R基团的位置：锯齿的上下方。,3.-转角,-转角常出现在肽链呈180回折处，多由4个氨基酸残基组成，第1个氨基酸的羰基氧与第4个氨基酸残基的氨基氢形成氢键。 -转角的第2个氨基酸多为脯氨酸。,4.无规卷曲,无规卷曲是指没有确定规律

12、性的那部分肽链结构。,模体（motif）超二级结构,在许多蛋白质分子中，二个或三个具有二级结构的肽段在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象，被称为模体。,三、蛋白质的三级结构(tertiary structure),疏水键、离子键、氢键、 Van der Waals力、二硫键等。,整条肽链 全部氨基酸 所有原子,（一）什么是?,主要的次级键：,三维空间的位置排布,每一条多肽链都有完整的三级结构,肌红蛋白 (Mb),维持蛋白质分子构象的各种化学键,a 氢键,b 离子键,c 疏水键,三级结构中疏水键数量最多，往往居于球状蛋白质内部。,+,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球

13、状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域。,3-磷酸甘油醛脱氢酶亚基的结构域示意图,3-磷酸甘油醛脱氢酶，每个亚基由两个结构域组成，N端形成的第一个结构域能与NAD+结合，第二个结构域（147-333氨基酸）能与底物3-磷酸甘油醛结合。,四级结构,亚基 (subunit),维持因素,2或2条以上多肽链，每一条多肽链具有完整的三级结构，并以非共价键相连。,四级结构中每条具有完整三级结构的多肽链,次级键：离子键、疏水键、氢键 无共价键,四、蛋白质的四级结构(quaternary structure),（多条肽链之间的作用）,一级结构 二级结构 三级结构 四级结构,定义,肽键,氨基

14、酸残基,基本单位,主要键,备注,模体,肽单元,整条肽链,亚基,氢键,疏离氢Van,离氢,结构域,亚基,蛋白质结构层次比较,蛋白质结构与功能的关系 The Relation of Structure and Function of Protein,第三节,（一）一级结构是空间构象的基础,一、蛋白质一级结构是高级结构与功能的基础,（二）一级结构是功能的基础,（三）重要蛋白质的氨基酸序列改变可引起疾病,例：镰刀形红细胞贫血,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,glu谷氨酸 val 缬氨酸,肌红蛋白/血红蛋白含有血红素辅基,血红素结构,二、蛋白质的功能依赖特定空间结构,（一）血红蛋

15、白、肌红蛋白结构,肌红蛋白(myoglobin，Mb),肌红蛋白是一个只有三级结构的单链蛋白质，有8段-螺旋结构。 血红素分子中的两个丙酸侧链以离子键形式与肽链中的两个碱性氨基酸侧链上的正电荷相连，加之肽链中的F8组氨酸残基还与Fe2+形成配位结合，所以血红素辅基与蛋白质部分稳定结合。,血红蛋白(hemoglobin，Hb),血红蛋白具有4个亚基组成的四级结构，每个亚基可结合1个血红素并携带1分子氧。 Hb亚基之间通过8对盐键，使4个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。,第一个氧分子与Fe2+结合,Fe2+半径变小，进入卟啉平面,牵动F8组aa残基,牵动其它亚基,Hb由T型变R型,第二亚基结合氧

16、的速度,第三亚基结合氧的速度,第四亚基结合氧的速度,Hb结合氧的过程：,（二）血红蛋白亚基构象变化可影响亚基与氧结合,变构效应(allosteric effect):,正协同效应（positive） 负协同效应（negative）,蛋白质空间结构的改变引起其功能的变化。,变构效应剂/配体 协同效应(cooperativity),几个概念：,（三）蛋白质构象改变可引起疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒

17、性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：人纹状体脊髓变性病、老年痴呆症、亨停顿舞蹈病、疯牛病等。,疯牛病中的蛋白质构象改变,PrPc -螺旋,PrPsc -折叠!,慢性进行性致死性神经变性病,朊蛋白病（蛋白构象病）,第四节,蛋白质的理化性质 The Physical and Chemical Characters of Protein,一、蛋白质具有两性电离的性质,当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。,蛋白质的等电点( isoelectric point, pI),体液中蛋白质的存在

18、形式？,二、蛋白质具有胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1100nm，为胶粒范围之内。,表面同种电荷 水化膜,蛋白质胶体稳定的因素:,三、蛋白质的变性与复性,在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。,蛋白质的变性(denaturation),造成变性的因素: 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。,应用举例: 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。,若蛋白质变

19、性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为复性(renaturation) 。,四、蛋白质的沉淀,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀（precipitation）。,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。,引起蛋白质沉淀的主要方法： 盐析在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠等。盐析沉淀的蛋白质不发生变性。 重金属盐沉淀蛋白质蛋白质可以与重金属离子如汞、铅、铜、银等结合成盐沉淀。沉淀的条件以介质pH稍大于蛋白质等电点pI为宜。 生物碱试剂以及某些酸

20、类沉淀蛋白质蛋白质可与生物碱试剂(如苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸)结合成不溶性的盐沉淀。 有机溶剂沉淀蛋白质可与水混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破坏蛋白质颗粒表面的水化膜，在等电点时使蛋白质沉淀。,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固（coagulation）。 因此，凝固的蛋白质一定发生变性。,五、蛋白质的凝固,总结：Pr变性、沉淀与凝固之间的关系 变性Pr不一定沉淀 沉淀Pr不一定变性 变性Pr不一定凝固 凝固的Pr一定变性,1、蛋白质在紫外光谱区有特征性吸收峰,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸

21、收峰。蛋白质的A280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,六、蛋白质的紫外吸收和呈色反应,蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。,蛋白质和多肽分子中肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。,2、应用蛋白质呈色反应可测定蛋白质溶液含量,茚三酮反应(ninhydrin reaction),双缩脲反应(biuret reaction),第五节 蛋白质的分离纯化 及其结构的测定,一、蛋白质的分离纯化,分子大小,超速离心,凝胶过滤,透析、超滤,生物学功能及 化学结构,亲合层析等,溶解度,等电点沉淀,盐析,有机溶剂沉淀,解离

22、性质,电泳（等电聚焦电泳、双向电泳等）,离子交换层析,二、蛋白质一级结构的测定,1953年F. Sanger等首次成功地测定出牛胰岛素的全部氨基酸排列顺序，开创了研究蛋白质一级结构的新纪元。 1967年，Edman等发明了自动测序仪，方便并且加速蛋白质一级结构的测定。 近几十年来，蛋白质测序工作蓬勃发展，分析技术不断革新，迄今为止已确定了数万种蛋白质的一级结构。,（一）蛋白质一级结构测定的一般策略,确定组成蛋白质分子的肽链(或称亚基)的数目； 拆分蛋白质分子的多肽链； 裂解蛋白质分子中的二硫键； 分离纯化单个亚基，测定各个亚基的氨基酸组成； 鉴定多肽链的氨基末端和羧基末端残基； 用两种或几种不

23、同的断裂方法在特异性位点裂解多肽链成较小的片段； 分离纯化各个裂解肽段，测定各肽段的氨基酸序列； 比较几种方法裂解获得的各肽段的氨基酸序列和不同的裂解位点，找出交错重叠的序列，确定各肽段在整条肽链中的位置，获得完整的氨基酸序列； 确定二硫键的位置，重建完整多肽链的一级结构。,测定多肽链的氨基末端和羧基末端氨基酸可作为整 条多肽链的标志点。Sanger曾用二硝基氟苯法，现多采 用丹酰氯法。,（二）多肽链氨基末端与羧基末端分析,羧基端的检测常采用羧基肽酶法。控制反应条件， 使C端氨基酸逐一释放出来，予以检测。,3.多肽链的氨基酸序列测定和重叠组合,在对多肽链进行测序前，先将多肽链用几种方法进行限制性水解，生成相互有部分重叠序列的一系列短肽， 用Edman降解法对每个短肽进行测序 将不同方法水解产生的肽链进行比较，找出重叠部分，进行累加，拼出完