质粒转化大肠杆菌ppt课件

1、。质粒转化到大肠杆菌中。1。重组质粒的鉴定质粒或其他载体重组后，通常会发生重组失败，包括质粒本身的环化。因此，需要进行筛选以成功找到重组质粒。目前常用的质粒和其他载体含有相应的抗生素抗性基因。如果重组成功，或者没有质粒的自身环化，并且表达了抗生素抗性基因，则转化的大肠杆菌将具有抵抗相应抗生素的能力，并且能够在含有抗生素的培养基上生长和传递。如果重组失败，大肠杆菌将无法抵抗抗生素而死亡。2.为质粒和其他载体的扩增做准备。因为大肠杆菌繁殖快，在合适的条件下只需20-30分钟就能繁殖一代，常用的质粒在大肠杆菌中可以繁殖到数百个拷贝。因此，通过培养成功转化的大肠杆菌，可以在短时间内大量扩增目标质粒。1

2、。实验目的，2。实验原理：用氯化钙处理特殊大肠杆菌制备感受态细菌。这些细菌每微克超螺旋质粒DNA可产生51062107个转化菌落，如一些插入了靶DNA片段的重组质粒。当质粒与这些大肠杆菌混合时，质粒粘附在大肠杆菌的表面。在42时，大肠杆菌出现热休克，质粒可通过大肠杆菌细胞膜上形成的缝隙进入细菌。然后，加入LB培养基，37振荡培养，可以使细菌复活，表达质粒编码的抗生素抗性基因，提高转化效率。成功转化的大肠杆菌可以通过相应的抗生素培养皿形成菌落。3。实验步骤：灭活剂/质粒，大肠杆菌转化，细菌挑选，振荡，细菌液体的聚合酶链反应，4。实验方法冻融法，连接产物在70灭活102分钟，(冰上解冻)50l大肠

3、杆菌感受态细胞和10l灭火器。在37下摇动1小时，以10000 rpm离心1分钟，室温下，除去800l上清液，将200l上清液重悬于1.5微升离心管中，涂布平板，在37的培养箱中培养12小时(时间不得超过20小时)，1，无菌落。2.菌落被苔藓覆盖并失败，这可能是由于抗生素浓度不足或失败。3.菌落已满，抗生素浓度过高，导致失败。4.殖民地出现并符合要求。(1)、(2)、(3)、(4)。5。结果分析和失败原因，(1)有菌落，表明转化成功，但有两种可能性：第一，质粒本身被环化；其次，重组是成功的。(2)无菌落，表明实验不成功。(3)菌落被苔藓覆盖，这可能是由于抗生素浓度不足或失效。(4)出现大斑块，

4、大部分是由霉菌污染引起的。1。结果分析，1。平板中的抗生素部分无效，克隆是混合细菌。2.当倒入Ka板时，培养基太热，因此应将其冷却至50以下，并应添加Ka抗生素。2.镀膜时，前后力过大，镀膜环或镀膜棒烧得太热，或者镀膜时没有冷却。3.感受态细胞在常温下长时间停留，这将严重影响它们的转化，并且在运行过程中它们移动迅速。4.手术太激烈，无法减少对细胞的机械损伤。记住，感受态细胞是脆弱的。5、操作流程不规范，细菌被污染。2。转换失败的原因。大肠杆菌感受态细胞的制备：(1)从大肠杆菌平板中选择新激活的大肠杆菌TOP10单个菌落，在50毫升的LB培养基中于37振荡过夜；(2)将菌悬液以1:100-1:5

5、0的比例接种于100毫升的液体培养基中，在37振荡培养2-3小时，直至OD600=0.5(3)将培养液转移到离心管中，在冰上静置10分钟，然后在4下以4100rpm离心10分钟。(4)弃去上清液，加入30毫升0.1摩尔/升预冷氯化钙溶液，重悬，置于冰上15-30分钟，离心10分钟；在4和4100转/分下；(5)弃去上清液，加入2毫升预冷的0.1毫升氯化钙，加入300微升无菌甘油，重悬并混合均匀，置于冰上几分钟；(6)包装，每管100微升，freez7.挑出细菌并摇动它们。(1)离心管标签。(2)将650l LB Ka抗生素吸入每个试管。(3)用牙签挑出单个细菌。(4)在摇床上摇菌(时间大于8h

6、)。准备：离心管、牙签、镊子、LB抗生素。8。蓝白色斑点筛选原理，蓝白色斑点筛选-目前，许多载体含有一小段大肠杆菌DNA，其中含有-半乳糖苷酶基因的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。一个多克隆位点被插入到这个编码区。受体菌株含有编码-半乳糖苷酶C末端氨基酸的序列。当插入外源基因时，在将两个基因溶解成一个后，-半乳糖苷酶被表达，并且在显色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)培养基中形成蓝色菌落。然而，当外源基因被插入到多重克隆的起点时，插入被失活，并且lacZ基因不表达，导致白色斑块。用不同的颜色区分重组体和非重组体。蓝点和白点的筛选：(1)未转化细菌无抗性，不生长；(2)用空载体转化的细菌，即没有重组质粒的细菌，生长成蓝色菌落；(3)用重组质粒转化的细菌，即目标重组细菌，生长成白色菌落。9。细菌液体的聚合酶链反应验证，添加