安捷伦高效液相色谱法PPT课件.ppt

1、高效液相色谱(higherperformanceliquidchromatography，HPLC )概述了高效液相色谱(HPLC )是从20世纪60年代末到70年代初发展的一种新的分离分析技术，随着改进和发展，现在它基于经典液相色谱，引入了气相色谱理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因此具有速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点。 为了更好地理解高效液相色谱的优势，现在从两个方面进行了比较：1，1高效液相色谱和古典液相色谱，高效液相色谱比古典液相色谱最大的优点是高速、高效、高灵敏度、高自动化。 所谓高速，是指分析速度比以往的液相色谱快数百倍。 由于经典色谱是重力供给，

2、流出速度非常慢的高效液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可分离103cmmin-1 .如苯的羟基化合物，7个成分可在1min内完成。 氨基酸的分离，用经典色谱，柱长约170cm，柱径0.9cm，流动相速度为30cm3h-1，用20小时以上分离氨基酸的高效液相色谱在lh以内完成。 此外，使用25cm0.46cm的LichrosorbODS(5)的柱，使用梯度溶出，在小于0.5h时可以分离尿中104成分。 对约占有机物总数80的高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前正在用高效液相色谱进行分离和分析。 (2)气相色谱法流动相为惰性气体，对成分无亲和力，即不发生相互作用，仅发挥载流子作用。 高效液

3、相色谱中流动相可以选择不同极性的液体，选择馀地大，能对成分产生一定的亲和力，参与固定对成分作用的激烈竞争。 因此，流动相对分离起到很大的作用，相当于增加控制和改善分离条件的参数，对于选择最佳分离条件非常方便。 (3)气相色谱一般在高温下进行，高效液相色谱在室温下工作良好。 也就是说，高效液相色谱采用了气相色谱和古典液相色谱的优点，用现代化手段进行了改进，得到了迅速的发展。 目前，高效液相色谱法广泛应用于生物学和医药上重要的高分子物质，如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高分子化合物、染料和药物等物质的分离和分析。 高效液相色谱仪器设备费用高、操作严格，这是其主要缺点。4、4，20-2高效

4、液相色谱、高效液相色谱的结构图一般分为高压输液系统、样品系统、分离系统和检测系统四个主要部分。 它还配备了梯度淋浴、自动采样、数据处理等辅助装置。 在其工作过程中，首先，高压泵将蓄能器中流动的相溶剂通过取样器输送到柱中，从控制器的出口流出。 注入要分离的样品时，流过取样器的储液槽的流动相同时把样品拿到柱中进行分离，依次进入检测器，记录仪记录从检测器发送来的信号，由此得到液相色谱图。5、6、1高压输液系统，因为用于高效液相色谱的固定相粒子非常细，所以对流动相的阻力大，为了使流动相快速流动，必须具备高压输液系统。 它是高效液相色谱最重要的部件，一般由罐、高压输液泵、过滤器、压力脉动电阻器等组成，其

5、中高压输液泵是核心部件。 良好的高压输液泵密封性好，输出流量一定，压力稳定，调整范围宽，能迅速交换溶剂和耐腐蚀等要求。 常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流泵的特征是，在一定的操作条件下，与柱的阻力变化无关，使输出流量保持一定的恒压泵，能够使输出压力保持一定，但是，流量因色谱系统的阻力而变化，因此，对保持时间的重视性差，分别具有优点和缺点。 现在，代替恒压泵的恒流泵在增加。 恒流泵也叫机械泵，分为机械注射器泵和机械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。、8、2个样品系统，高效液相色谱列比气相色谱列短得多(约530cm )，因此列外的扩展(也称为列外效果)很引人注目。 柱外扩展是指柱外要素引起

6、的峰值扩展，主要在样品系统、连接管道和检测器中存在死区容量。 柱外的扩展可以分为柱前和柱后的扩展。 由于样品系统是引起前进幅度的主要因素，所以高效液相色谱对样品技术要求很高。、10、3分离系列，列是液相色谱的心脏部件，包含列和固定相两部分。 柱管的材料有玻璃、不锈钢、铝、铜和衬里光滑的高分子材料的其他金属。 玻璃管的耐压有限，所以多使用金属。 一般柱长530cm，内径45mm，凝胶柱内径312mm，内径大，为25mm以上。 一般在分离前准备预柱，预柱内的填充物和分离柱完全相同，因此，冲洗溶剂通过预柱时固定相饱和，通过分离柱时固定相不溶出，保证分离技术的性能不受影响。 柱子装填的好坏对柱子的效果

7、有很大影响。 细粒度的填充剂(20m )，一般用均质填充法安装柱，将填充剂均质化后，在高压泵的作用下，迅速压入装有溶出液的柱中，洗净后待机。11、4检测系统，液相色谱有两种基本类型的检测器。 一种是溶质性检测器，只对分离出的成分的物理或化学特性作出响应，属于这种检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一种是整体检测器，响应样品和洗脱液的整体物理或化学性质，属于这种检测器的有示差折射、电导检测器等。 其中，常用的检测器是：(l )紫外检测器(2)荧光检测器(3)差示折射率检测器的大部分物质分别具有不同的折射率，所以差示折射率检测器是通用型的检测器。 灵敏度达到10-7gcm-3。 主要缺点是对

8、温度变化敏感，不能用于梯度淋浴。 (4)电导检测器(5)附属系统包括脱气、梯度淋浴、恒温、自动采样、馏分采集和数据处理等装置。 其中梯度淋浴装置是高压液相色谱中特别重要的附属装置，13，20-3高效液相色谱的固定相和流动相，()固定相高效液相色谱固定相为受到高压能力而被分类，分为刚性固体和硬凝胶两种。 刚性固体以二氧化硅为基质，能承受7.O1081.O109Pa的高压，能制造直径、形状、空隙率不同的粒子。 在二氧化硅表面结合各种官能基，是结合固定相，可以扩大应用范围，是现在使用最广泛的固定相。 硬橡胶主要用于离子交换和尺寸阻隔色谱，是聚苯乙烯和二乙烯基苯交联而成的。 允许压力的上限为3.510

9、8Pa。 固定相按孔的深度分类，分为表面的多孔型和全多孔型固定相两种。 表面多孔型固定相，其基体为实心玻璃珠，玻璃球外包复有多孔质活性物质，如硅胶、氧化铝、离子交换剂、分子筛、多酸胺等。 表面活性材料是硅胶的固定相，如海外的Zpax、CorasilI和II、Vydac、Pellosil和上海试剂厂的壳玻璃珠等表面活性物质是Pellumina之类的氧化铝的固定相，如Pellion之类的聚酰胺。 这种固定相的多孔层厚度小，孔浅，死亡体积相对小，出峰快，柱效应也高的粒子大，渗透性好，柱的安装容易，在倾斜淋浴时能够迅速取得平衡，适用于通常的分析。由于多孔层的厚度薄，最大容许量受到限制。15、2全多孔型

10、固定相是直径10nm的硅胶微粒凝聚而成的。 例如海外的Porasil、Zobbex、Lichrosorb系列、上海试剂一厂的沉积硅珠、青岛海洋化学工厂的YWG系列、天津试剂二厂的DG系列等。 也可从氧化铝微粒中凝聚全多孔型固定相，例如海外的LichrosorbALOXT。 由于这种固定相粒子细(510m )，孔还浅，传递速度快，容易实现高效、高速。 特别适合复杂混合物的分离和痕迹量的分析。、因此，正确地选择流动相直接影响成分的分离度。 对流动相溶剂的要求，(1)对待测样品必须具有适当的极性和良好的选择性。 (2)溶剂配合检测器。 对于紫外吸收检测器，请注意检测器的波长比溶剂的紫外截止波长长。

11、所谓溶剂的紫外截止波长，是指比截止波长小的放射线通过溶剂时，溶剂强烈吸收该放射线，此时溶剂被视为光学上不透明，对成分的吸收测定有很大影响。 表20-2显示了几种常用溶剂的紫外截止波长。 在折射率检测器中，要求选择与成分的折射率大不相同的溶剂作为流动相，以达到最高灵敏度。 高纯度，18，19，3。 由于高速液相灵敏度高，所以也要求流动相溶剂的纯度高。 不纯的溶剂会导致基线不稳定，或产生“伪峰”。 微量杂质的存在使截止波长值增加50IOOnm。 (4)化学稳定性好。 不能选定与样品反应或聚合的溶剂。 (5)低粘度。 使用高粘度溶剂会增加压力，不利于分离。 常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙晴等。 但

12、是，也不应该采用粘度过低的溶剂。 例如戊烷、乙醚等在柱或检测器内形成气泡，影响分离。20，20-4高效液相色谱的主要类型和选择，)单液分配色谱(LLPC )，在液-液相色谱中，流动相和固定相为液体，适用于各种样品类型的分离和分析。 极性和非极性的、水溶性和油溶性的、离子型和非离子型的化合物。 1分离原理液分配色谱的分离原理基本上与液液提取相同，根据物质对不相溶的两种液体的溶解度，有不同的分配系数。 不同的是液相色谱的分配通过柱进行，这种分配平衡可以反复多次，引起各成分的差速移动，提高分离效率，分离复杂的成分。 由于液相色谱中的流动相参与了选择竞争，21、2固定相的选择比较简单。 只需使用几种极

13、性不同的固定液就能解决分离问题。 例如，最常用的强极性固定液、一氧化二丙、中极性的聚乙二醇、无极性的角鲨烷等。 为了更好地解决固定液流出到载体上的问题。 发生了化学键固定相。 是通过化学反应将各种有机基团结合在载体表面的方法。 由于这取代了固定液的机械涂布，对液相色谱的迅速发展起到了很大的作用，可以认为其出现是液相色谱的一大突破。 这是现在使用最广泛的固定相。 据统计，约3/4以上的分离问题在化学键固定相进行。 详细介绍之后。 为了避免固定液流出，22、3流动相用液相色谱法。 对流动相的基本要求之一是，流动相尽量不与固定相相容，流动相和固定相的极性差越显着越好。 根据使用的流动相和固定相的极性

14、程度，分为正相分配色谱和反相分配色谱。 当流动相的极性小于固定相的极性时，称为正相分配色谱，适于极性化合物的分离。 其流出顺序，极性小的一方先流出，极性大的一方后流出。当流动相的极性大于固定相的极性时，称为反相分配色谱。 适合无极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱完全相反。23、(二)化学结合色谱(CBPC )、使用化学结合相的液相色谱被称为化学结合色谱，简称结合色谱。 由于耦合固定相非常稳定，在使用中不易流失，适合梯度淋浴，尤其适合分离电容因子的k值范围宽的样品。 因为结合在载体表面的官能团是各种极性，所以适合于各种各样的样品的分离。 1结合固定相类型是用于制造结合固定相的载体，大部分是硅

15、胶。 通过硅胶表面的硅烷醇基(si-oh )与有机成分结合，可以得到各种性能的固定相。 一般可以分为3种(1)疏水基，如不同链长的烷烃(C8和C18 )。 )或苯基等(2)极性基，例如氨基丙基、氰乙基、醚基、醇基等。 (3)作为阴离子交换基的氨基、第4季度的电镀盐等离子交换基； 作为阳离子交换基的磺酸等，24，2键固定相的调制(l )硅酸酯(Si一OR )键固定相是液相色谱最初使用的键固定相。 醇与硅烷醇基发生酯化反应： Si0HROHSiORH20由于这种结合固定相的有机表面为单体，因此具有良好的传递特性，但是这些被酯化的硅胶填充剂容易水解，热不稳定，因此不含水或醇(2)SiC或si-n共价

16、键固定相的制造反应如下所述。 25、共价键固定相不易水解，热稳定。 缺点是使用水溶液时，PH必须限制在48的范围内。26、(3)甲硅烷化(SiOSiC )键固定相的制造反应具有这样的键固定相热稳定、不易吸水、耐有机溶剂的优点。 能在70以下，PH=28的范围内正常工作，广泛应用。27、3反相健相色谱法，该方法的固定相采用了极性小的结合固定相，例如硅胶一C18H37、硅胶一苯基等。 流动相使用甲醇十、乙眼一水、水和无机盐的缓冲溶液等极性强的溶剂。 多用于分离多环芳香族烃等低极性化合物； 如果把含有一定比例的甲醇或乙眼的水溶液作为流动相，如果把也能用于极性化合物分离的水和无机盐的缓冲液作为流动相，

17、就可以分离有机酸、有机碱、酚类等容易解离的样品。 反相耦合色谱具有柱效应高，能够得到没有尾迹的色谱峰的优点。 关于反相结合色谱的分离机理，可以用所谓的疏溶剂作用理论进行说明。 这个理论认为非极性的烷基结合相结合在硅胶表面的十八烷基的“分子毛”，该“分子毛”具有很强的疏水性特性。 另外一方面，在以极性溶剂为流动相分离含有极性官能团有机化合物的情况下，分子中的非极性部分与固定相表面的疏水性烷基发生缔合作用，被分离物的极性部分受到极性移动相的作用，从固定相分离，使保持作用减少(参照图20-4 )。 很明显，两种力的差异决定了分子在色谱中的保持行为。28，29，4 .正相结合色谱法用极性的有机基，CN，NH2两羟基等与硅胶表面结合，向作为固定相的非极性或极性小的溶剂(烃类等)中加入适当的极性溶剂(氯仿、醇、乙基等)作为流动相此时，成分的分配比k的值随着其极性的增加而增大，但随着流动相的极性的增加而下降。 这种色谱法主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适合分离不同种类的化合物。 30，5 .离子性键合色谱是以壳型或全多孔微粒型硅胶为基质，使各种离子交换基，例如so3h1ch2nh2、C00H、CH2N(CH3)等化学键合时，形成离子性键合色谱的固定相的移动