第5章 现代高技术--生物技术

1、第一节生物技术一、生物技术的内容1生物技术的定义综合运用现代生物学、化学、工程学的手段，直接或间接地利用生物体、生命体系和生命活动过程生产有用物质的一门高级应用技术科学。,2内容（1）基因工程：重组DNA技术（2）细胞工程：用细胞生物学方法对细胞进行改造，使细胞按人类需要生产有用的产品，或者遗传物质，从而培育新的生物类型。包括：细胞杂交技术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。（3）蛋白质与酶工程：利用酶促反应的高效率和专一性，并借助于工艺手段和生物反应器进行某种产品生产的技术体系。,（4）发酵工程：微生物工程利用微生物发酵作用，通过现代工程技术手段来生产有用物质，或者用微生物手段来生产有用物质，

2、或者把微生物直接用于生物反应器的技术。事实上基因工程、细胞工程、酶工程的成果，只有通过发酵工程，才能形成新的生物技术产业。,二、基因工程技术和应用,基因工程是生物技术的核心部分。,基因工程的操作可以简述如下：,1、基因工程技术,基因工程的操作流程,将外源基因（又称目的基因，是一段DNA片断）组合到载体DNA分子中去，再把它转到受体细胞（亦称寄主细胞）中去，使外源基因在寄主细胞中增值和表达，从而得到期望的由这个外源基因所编码的蛋白质。,所以，基因工程的操作包含以下步骤：获得目的基因构造重组DNA分子转化或转染表达蛋白质产物的分离纯化,到哪里去找目的基因？从组织细胞中可以分离得到人/小鼠的全套基因

3、，称为基因文库。文库中基因总数就人来说约有3万个基因。如何从中把需要的基因找出来？采取“钓”的办法。这个办法通常称为印迹法。,（1）获得目的基因,返回,印迹法,内切酶切开DNA,电泳,印迹转移,放射性探针杂交,胶片显影,印迹法的主要步骤：（1）基因文库DNA用限制性内切酶处理。（2）DNA片断混合物通过电泳分离。（3）电泳后，通过印迹技术转到酯酰纤维薄膜上，以便操作。（4）用已知小片断DNA作为探针，互补结合需要找的基因片断。（5）探针DNA片断已用放射性元素标记，使胶片感光后可看出。,印迹法的关键是“分子杂交”，利用碱基配对的原则，用一段小的已知的DNA片断去寻找（“钓”）大的未知的基因片断

4、。探针DNA片断从何而来？根据目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N端1520个氨基酸序列，按三联密码转为40-60核苷酸序列，人工合成，即为探针DNA片断。,（2）目的基因的扩增,用上面的方法“钓”出的目的基因，数量极少，所以，接下来必须经过扩增，亦称为基因克隆。获得相当数量的目的基因后，才能继续下一步操作。,克隆生物分子，细胞，生物个体的无性增殖过程都称为克隆。,返回,（3）PCR把寻找目的基因和扩增目的基因两步操作并成一步。,PCR法，又称多聚酶链式反应，是近年来开发出来的基因工程新技术，它的最大优点是把目的基因的寻找和扩增，放在一个步骤里完成。,PCR操作流程,900C,500C,700C,

5、PCR反应分三步完成：第一步900C高温下，使混合物的DNA片断因变性而成单链。第二步500C温度下，引物DNA结合在适于配对的DNA片断上。第三步700C温度下，由合成酶（DNA高温聚合酶）催化，从引物开始合成目的基因DNA。,PCR的三个步骤为一次循环，约需510分钟。每经一次循环，所找到的目的基因扩充一倍。经过20次循环，即可扩增106倍，总共只需几个小时。,（4）构造重组DNA分子,首先要有载体。载体有好几种，常用的有：质粒环状双链小分子DNA，适于做小片断基因的载体。噬菌体DNA线状双链DNA，适于做大片断基因的载体。,返回,用质粒构建重组NA分子,返回,用噬菌体DNA构建重组DNA

6、分子,其次要把目的基因“装”到载体中去。“安装”的过程，需要好几种工具酶，其中关键的酶叫限制性内切酶。此酶识别一定碱基序列，有的还可切出“粘性”末端，使得目的基因和载体的连接非常容易。,下图,限制性内切酶识别特定的碱基序列,返回,限制性内切酶造成粘性末端有利于重组DNA分子的构建,（5）转化/转染表达蛋白质分离,把构造好的重组DNA分子送进寄主细胞，亦需要适当的技术方法。若受体细胞是细菌，通常称转化；若受体细胞是动/植物细胞，通常称转染。,重组DNA分子进入寄主细胞后，其中的目的基因能否表达，表达效率高低，还有很大差别。表达通常是指目的基因编码的蛋白质合成。基因工程的最后一步，是把所获得的蛋白

7、质分离纯化，得到蛋白质产品。,返回,生产基因工程产品的,生物反应器,2、基因工程的应用,基因工程技术已经在医学、工业、农业等各个领域得到了广泛的应用。（1）在医学上的应用基因工程被用于大量生产过去难以得到或几乎不可能得到的蛋白质肽类药物。,胰岛素1000磅牛胰10克胰岛素200升发酵液10克胰岛素,干扰素1200升人血1升发酵液23万美元/病人200300美元/病人,（2）用于提高奶酪产量生产奶酪的凝乳酶传统上来自哺乳小牛的胃。现在可以通过基因工程办法，用酵母生产凝乳酶，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛凝乳酶基因胃转入啤酒酵母凝乳酶凝乳酶制造奶酪,（3）转基因动物和植物转基因动物首先在小鼠获得成功

8、。现在转基因动物技术已用于牛、羊，使得从牛/羊奶中可以生产蛋白质药物。称为“乳腺反应器”工程。转基因植物亦已在大田中广为播种。,把大鼠生长因子转入小鼠,得到巨大型的转基因小鼠。,试验中的“金大米”,1994年出现在美国市场上的转基因西红柿,（4）工程菌在环境工程中应用美国GE公司构造成功具有巨大烃类分解能力的工程菌，并获专利，用于清除石油污染。,喷洒工程菌清除石油污染,无冰晶细菌帮助草莓抗霜冻,三、从一个细胞到一只羊细胞工程：用细胞生物学方法对细胞进行改造，使细胞按人类需要生产有用的产品，或者遗传物质，从而培育新的生物类型。包括：细胞杂交技术、单克隆抗体、细胞大规模培养技术。,1、多利羊风暴1

9、997227Nature（385：810813）英国爱丁堡罗斯林研究所伊恩威尔穆特小组：多利羊1996.7出生1996.11收到文章1997.2文章发表,多利羊之父威尔穆特,多利羊成为明星,多利和它的孩子,文章发表，在全世界引起巨大反响。一方面学术界高度评价1997.3.2美国华盛顿邮报奥勒冈州沃尔小组：成功克隆两只恒河猴（96.8出生）1997.3.5台湾地区吴明杰小组：5只克隆猪。,沃尔小组成功克隆两只恒河猴,1997.3.5台湾地区吴明杰小组：5只克隆猪,在日本克隆成功的牛,世界第一匹克隆马诞生,另一方面，人们马上意识到克隆人的威胁。政界纷纷出来表态。1997.3.4（美）克林顿总统宣布

10、：禁止联邦政府资助人体克隆实验。1997.3.5（意）卫生部长在众议院宣布：禁止人体和动物克隆。,1997.3.11世界卫生组织（WHO）宣布：禁止人体克隆试验。1997.3.11欧盟委员会宣布：反对人体克隆试验。中国卫生部宣布：禁止人体克隆试验。,一条科学成就的宣布，在全世界范围内，在短短几十天左右时间，从学术界到经济界、政界引起巨大而深刻的反响，是空前的。“克隆”一词也顿时变得妇孺皆知。,2、从一个细胞到一只羊,所有有性繁殖的生物，都是从一个受精卵发育到完整的生物体。,（1）细胞分化在个体发育中，细胞后代在形态结构和功能上发生差异的过程，称为细胞分化。,（2）细胞的发育潜能由一个细胞可能分

11、化发育出多少种细胞？这就是细胞的发育潜能。大致有三种不同的发育潜能。,全能性具有能使后代细胞形成完整个体的潜能的细胞称全能性细胞。例如：受精卵,卵子受精过程,精子正在穿越卵子外膜,核融合,多能性具有分化出多种组织或细胞（但是不能形成完整个体）的潜能的细胞称多能性细胞。例如，生血多能干细胞,从多能生血干细胞可以分化发育出许多种血细胞。,单能性只能分化成一种细胞的干细胞称单能干细胞。例如，单能生血干细胞,单能生血干细胞,单能生血干细胞,（3）对于植物来说，分化成熟的植物细胞体，仍保持全能性，仍有可能发育成完整植株。第一例从一个植物体细胞一棵植株的实验。,无性繁殖杨柳插枝繁殖山芋块根繁殖马铃薯块茎繁

12、殖这些都还不是严格意义上的一个体细胞一棵植株,从单个细胞到愈伤组织到整个植株,胡萝卜,从植物体细胞到一棵完整的植株,植物体细胞具有全能性,对于动物来说：随着分化的演进，细胞逐渐丧失其分化潜能。全能性多能性单能性分化成熟的体细胞。,实际上，动物细胞丧失全能性的过程，开始得很早。,（4）分化成熟的动物细胞已失去全能性。不可能发育成为完整的动物个体。原因何在？陆续出现一些探索动物细胞全能性丧失原因的实验。,1952豹蛙囊胚细胞核去核卵母细胞蝌蚪可育的蛙,爪蟾：肠上皮细胞核仍保持全能性,爪蟾的核移植实验,爪蟾：肠上皮细胞核仍保持全能性,3、多利羊实验的设计和实施,（1）实验过程,严密的实验设计精心的操

13、作过程严格的结果检验,实验过程,细胞核受体,细胞核供体,注射促性腺激素释放激素经28-33h排卵,9天胚26天胎羊6岁母羊孕期最后三个月胚细胞胎羊细胞乳腺细胞,培养于0.5%胎牛血清培养基中，使从生长周期中出来停顿于G。,3436h取出核,分别进行,培养在羊输卵管上6天，分裂成长至桑椹期或囊胚期,细胞融合,移入假母（苏格兰黑脸母羊）子宫,13胚/头假母,5060天，超声检查，21头胎羊，以后每14天查一次。最后产出八头小羊分属三个核供体来源。胎羊丢失率：62%（13头）以形态特征，DNAmicrosatelliteanalysis产出小羊均显示供体羊特征,（2）实验成功的关键，血清饥饿使细胞核

14、和去核卵细胞处于细胞周期中相匹配的阶段。使结合在基因（DNA）上的调控蛋白脱落下来。重新编程（repreogram,remodel）,对多利羊实验的质疑。质疑：来自乳腺的细胞究竟是不是分化成熟的体细胞？(原来供细胞的母羊已死)回答：在Nature原文中已说明，怀孕期间胚胎细胞可能进入母体，1/106可能性。需要进一步实验。,4、多利羊实验的理论意义和实践意义,（1）理论意义证实分化成熟的动物细胞核仍具全能性。证实细胞质对胚胎发育分化的决定性。,（2）实践意义蛋白质多肽类药物(胰岛素、凝血因子、干扰素、生长因子)年产（1998）76亿美元2000年产（估计）185亿美元,80年代初期到九十年代初

15、期这10年内基因工程用于生产蛋白质多肽类药物有很大发展。细菌、酵母表达系统糖修饰、蛋白质折叠。动物细胞培养太贵、成本高。转基因动物亦已成功。,转基因动物提高了蛋白质肽类药物的产量产量细胞培养法5%转基因羊羊奶中25%50%英国罗斯林研究所和PPL制药公司联合，50只转基因羊，已传四代。希望用克隆法生产4000只基因工程奶羊。,乳腺生物反应器荷兰生产EPO的转基因牛年产值40亿美元英国生产-胰蛋白酶一杯羊奶6000美元制剂的转基因羊中国中科院发育所合作1998年6月得到两只体细扬州大学胞克隆羊，能分泌乳腺药物,问题是：,所得到的转基因动物在无性生殖过程中，容易丢失转入的基因和特性。对克隆（无性生殖）大动物有了强烈的客观需求。,器官移植：角膜皮肤肾肝肺心脏等等,器官移植大量开展需要大量供体器官。,人体器官的代用品来自猪。,获得供器官移植的纯种猪需要：去掉猪抗原性移入人抗凝血因子近交20代约需20年克隆技术使纯种猪培育