DNA提取及常见问题分析.ppt

1、核酸提取与分析常见问题(1) DNA，主讲人：张磊，2009年8月12日，第2部分：DNA提取方法介绍，第3部分：DNA提取常见问题、原因分析及对策，内容，第1部分：前言，核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，也是分子生物学研究的主要对象，因此核酸提取是分子生物学中最重要的实验技术前言， 第二部分：介绍了DNA提取方法、几种DNA提取方法、基因组DNA提取方法、十六烷基三甲基溴化铵法、线粒体和叶绿体DNA提取方法、差速离心结合十二烷基硫酸钠裂解法、基因组DNACTAB法、十六烷基三甲基溴化铵原理(植物DNA提取的经典方法)、十六烷基三甲基溴化铵(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子洗涤剂

2、。 核酸可以通过用有机溶剂提取，除去杂质如蛋白质、多糖和酚类，然后用乙醇沉淀来分离。注：十六烷基三甲基溴化铵溶液在15以下会形成沉淀，因此在加入到冷的植物原料中之前必须预热。三盐酸(pH8.0)提供了一个缓冲环境，以防止核酸被破坏。乙二胺四乙酸螯合Mg2或Mn2离子并抑制脱氧核糖核酸酶活性。氯化钠提供高盐环境，使DNP完全溶解并以液相存在；CTAB溶解细胞膜并结合核酸，这使得核酸易于分离。-巯基乙醇是一种抗氧化剂，可有效防止苯酚氧化成醌，避免褐变，并使苯酚易于去除。基因组DNACTAB法和改进的CTAB提取缓冲液配方，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是一种酚的络合物，它能与多酚类物质形成不溶性络合物，

3、有效去除多酚类物质，减少DNA中的酚污染；同时，可与多糖结合，有效去除多糖。基因组DNACTAB法、CTAB法流程图、植物材料、裂解物、上层溶液、液氮研磨、提取、细胞裂解、干燥和溶解、离心洗涤、乙醇沉淀、DNA溶液、基因组DNACTAB法、十二烷基硫酸钠法、十二烷基硫酸钠是一种阴离子去污剂，用于高温(5565)下增加盐的浓度(KAc或NH4Ac)并降低温度(冰浴)以沉淀蛋白质和多糖杂质，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用苯酚/氯仿提取，水相中的DNA重复提取后用乙醇沉淀。SDS法DNA提取缓冲液、SDS法流程图(以动物组织为例)、基因组DNASDS法、基因组DNA的其他方法、物理方法：玻璃珠法

4、、超声波法、研磨法、冻融法、化学方法：异硫氰酸胍法、碱裂解法、生物方法：酶法、根据不同的细胞裂解方法、基因组DNA的其他方法、吸附材料结合法、根据不同的核酸分离纯化方法，都有快速高效的优点。低盐和高酸碱度结合核酸，高盐和低酸碱度洗脱。它适用于高纯度要求的实验。磁性粒子上的不同基团可以吸附不同的物体，从而达到分离的目的。基因组DNA的其他方法：浓盐法：有机溶剂提取法：密度梯度离心法：RNP和DNP是通过它们在盐溶液中的不同溶解度来分离的，有机溶剂用作蛋白质变性剂，同时抑制核酸酶降解，并利用不同含量的不同密度的原理来分离各种含量，细胞器DNA差速离心和差速离心原理是一种利用不同物质比重来分离混合物

5、的方法。将待分离的物质置于均匀介质(蔗糖)中，以一定速度离心，比重较高的物质优先沉降，比重较低的物质在上层，从而被分离。线粒体和叶绿体是生物体中的半自主细胞器，它们可以自己编码蛋白质。它们的比重和大小是恒定的，因此在相同的离心场中，沉降速度也是恒定的。根据这一原理，细胞中的各种成分通过不同速度的离心分离。第二部分：DNA提取常见问题、原因分析及对策；第三部分：DNA提取常见问题、原因分析及对策；DNA提取的基本步骤；一、材料准备破碎细胞或胶囊内容物的释放。核酸的分离和纯化。核酸的沉淀或吸附以及杂质的去除v .核酸在适当的缓冲液或水中的溶解；材料制备，最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不应反复

6、冷冻和解冻以提取血液基因组DNA，有核细胞(白细胞)的培养时间不应过长，否则会导致DNA降解。含有病毒的液体材料的DNA含量较少，在提取、基因组DNA提取和细胞裂解之前应进行富集。材料要合适，太多会影响裂解，导致不同材料的脱氧核糖核酸减少和纯度降低。选择合适的裂解预处理方法：植物材料、液氮研磨动物组织匀浆或液氮研磨组织培养细胞蛋白酶k细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高温浴、规则温和振荡、基因组DNA提取、核酸分离纯化，当DNA被吸附材料分离时，应提供相应的缓冲体系，有机(苯酚/氯仿)提取应充分混合，但当两相被温和离心分离时， 根据不同材料的特性，应保证一定的速度和时间，提取过程应辅以相应的杂质

7、去除方法，如基因组DNA提取、核酸分离纯化、蛋白质去除：酚/氯仿提取用变性剂(SDS、异硫氰酸胍等)处理。 3)高盐洗涤蛋白酶和多糖去除：高盐法：当用乙醇沉淀时，向溶液中加入1/2体积的5mL氯化钠进行沉淀，高盐可以溶解。多糖水解酶降解多糖。向提取缓冲液中加入一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基反应，从而去除多糖。用聚乙二醇8000代替乙醇沉淀脱氧核糖核酸：将200升20%聚乙二醇8000(含1.2毫升氯化钠)加入500升脱氧核糖核酸溶液中，冰浴20分钟。核酸的分离和纯化，多酚的去除：添加试剂以防止苯酚氧化：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等。添加易于与酚类物质结合的试剂

8、，如聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇(聚乙二醇)，这些试剂与酚类物质有很强的亲和力，可防止酚类物质与脱氧核糖核酸结合。核酸的分离纯化，盐离子的去除：70乙醇洗涤，核酸沉淀，沉淀，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀时加入1/10体积的NaAc(pH5.2，3M)，沉淀会更加充分，有利于沉淀后用70%乙醇洗涤，从而去除盐离子等。干燥脱氧核糖核酸，使乙醇可以完全挥发(不要过度干燥)。如果建议使用碲缓冲溶液长期储存，碲中的乙二胺四乙酸可以螯合Mg2或Mn2离子，并抑制去离子水的浓度值为8.0。它可以防止核酸酸解和提取基因组DNA，其中含有蛋白质，多糖和多酚杂质。在脱氧核糖核酸溶解之前，会有酒精残留，酒精会抑制在随

9、后的酶水解反应中残留在脱氧核糖核酸中的金属离子。再次纯化DNA，除去蛋白质、多糖和多酚等杂质(具体方法见上文)，再沉淀DNA，使酒精完全挥发，增加70次酒精洗涤(2-3次)。DNA提取中常见的问题、原因、对策、材料不新鲜或反复冻融不抑制内源核酸酶的活性。提取过程过于激烈，外源核酸酶通过机械干扰污染了DNA，尽量采用新鲜材料。材料的冷冻保存避免了反复的冷冻和解冻。在液氮中研磨或匀浆组织后，解冻前应加入裂解缓冲液。从富含内源核酸酶的物质中提取DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量。细胞裂解后的后续操作应尽可能温和。所有试剂都应该用无菌水制备。消耗品应在高温下灭菌，脱氧核糖核酸应单独储存在缓冲液中，以避免反复冻融。DNA提取中的常见问题，对策、原因、实验材料较差或较少破碎或开裂，沉淀不完全时DNA丢失洗涤，尽量选择新鲜(