分子生物学课件第二章.ppt

1、第二章 遗传的物质基础,生物亲代与子代之间，在形态、结构和生理功能上常常相似，这就是遗传现象。 生物的遗传特性，使生物界的物种能够保持相对稳定。,根据现代细胞学和遗传学的研究得知，控制生物性状的主要遗传物质是脱氧核糖核酸（DNA）。,生物的各项生命活动都有它的物质基础。生物遗传的物质基础是什么呢？,金丝猴的后代仍然是金丝猴,牛的后代仍然是牛,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 二级结构的其他形式 第五节 DNA的超螺旋结构,第一节 遗传物质的本质,DNA是遗传物质 RNA也可以作为遗传物质 核酸之外的其他遗传物质？,1.1 核素的发现 1.2 肺炎

2、双球菌转化实验 1.3 大肠杆菌噬菌体捣碎实验 1.4 化学实验 1.5 遗传物质必须具备以下基本条件,1 DNA 是遗传物质,1 DNA 是遗传物质,1.1 核素的发现 1868年，瑞士F. Miescher从绷带上的白细胞核中分离出一种含磷的酸性物质，命名为核素（nuclein）。 核素的主要成分是染色质，是DNA和蛋白质的混合物。这是首次对基因的化学本质进行探索。 核酸 (nucleic acids) 这一名词于20年后才被正式启用。,19世纪末期， DNA和RNA已经从细胞中分离出来，为进一步的化学分析奠定了基础。 20世纪30年代，P. Levene和W. Jacobs等搞清了DNA

3、和RNA的基本化学组成。还注意到了DNA和RNA所含核糖的差异。,1.2 肺炎双球菌转化实验（transformation）,肺炎双球菌有两种类型 光滑型（S型） 粗糙型（R型）,1） 1928年，英国 F. Griffth 2) 1944年，O. Avery,图 Griffth的肺炎双球菌的转化实验,1.3大肠杆菌噬菌体捣碎实验,噬菌体侵染细菌的过程：,最后，这些噬菌体由于细菌的解体而被释放出来，再去侵染其他的细菌。,大肠杆菌噬菌体捣碎实验 1952年Herchey 和Chase。 用32P和35S分别标记噬菌体的DNA和蛋白质，发现只有DNA进入宿主细菌内，而蛋白质则没有。,1.4 化学实

4、验 1950年以后，Chargaff、Markham等。 不同生物的碱基组成不同，具有严格的种的特异性。 单体在不同生物中都是相同的。 AT GC等量 四种碱基的分子浓度可变。,1.5 DNA是遗传物质的间接证据,（1）一种生物不同组织的细胞，不论年龄大小，功能如何，它的DNA含量是恒定的，而生殖细胞精子的DNA含量则刚好是体细胞的一半。多倍体生物细胞的DNA含量是按其染色体倍数性的增加而递增的，但细胞核里的蛋白质并没有相似的分布规律。,（2）DNA在代谢上较稳定。 （3）DNA是所有生物的染色体所共有的，而某些生物的染色体上则没有蛋白质。,（4）DNA通常只存在于细胞核染色体上，但某些能自体

5、复制的细胞器，如线粒体、叶绿体有其自己的DNA。 （5）在各类生物中能引起DNA结构改变的化学物质都可引起基因突变。,（1）储存并表达遗传信息: （2）能够复制，把遗传信息传递给子代： (3) 物理和化学稳定性： （4）有遗传变化的能力：,1.6 遗传物质必须具备以下基本条件：,第一节 遗传物质的本质,DNA是遗传物质 RNA也可以作为遗传物质 核酸之外的其他遗传物质？,2 RNA也可以作为遗传物质,2.1 RNA病毒: 一些病毒也采用另一种核酸RNA作为遗传物质，如逆转录病毒。 烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus, TMV）,遗传物质是RNA的实验证据,2.2 类病毒（v

6、iroid）,类病毒：不具蛋白质衣壳，仅有RNA组成的新病毒。 1922年 美国 马铃薯纺锤形块茎病毒（Potato spindle tube viroid，PSTV ）。 特点： 单股闭合环状的RNA分子，分子量约105Da。 能耐受紫外线和作用于蛋白质的各种理化因素，在90下仍能存活。,类病毒复制如何进行？ 由宿主细胞的酶来完成，其RNA作为复制模板。 类病毒现在仅在高等植物中发现，一般通过接触，擦伤，节肢动物和菟丝子传播。,第一节 遗传物质的本质,DNA是遗传物质 RNA也可以作为遗传物质 核酸之外的其他遗传物质？,3 非核酸的其他遗传物质,朊病毒Prion ：又称蛋白质侵染因子。 朊病

7、毒是一类能侵染动物并在宿主细胞内复制的小分子的无免疫性疏水蛋白质。,羊瘙痒病 1982年，美国 斯坦利普鲁辛纳S.B.Prusiner发现羊瘙痒病是蛋白质侵染引起的疾病，并称为“Prion”即朊病毒。 马鹿和鹿的慢性消瘦病、猫的海绵状脑病。 1996年春天“疯牛病”：牛海绵状脑炎 人慢性退化性紊乱疾病：老年痴呆、帕金森氏病、糖尿病等。,朊病毒引起的风波,朊病毒特点：,仅有蛋白质组成， 分子量29kDa， 具有蛋白质性质：能被蛋白酶灭活，不被核酸酶和辐射灭活，对许多理化因子有很强的抵抗力。,1997 年Prusiner 对朊病毒蛋白 的感染机制进行了探讨。 朊病毒蛋白（PrP）以两种形式存在：

8、正常的脑组织中发现的PrPC不具有感染性，对蛋白酶敏感，可以被完全降解； 致病组织中的PrPSC具有感染性，具有抗蛋白酶的性能。,PrPC和PrPSC的一级结构完全相同，但二级结构差异很大： PrPC：螺旋的含量约为40，几乎没有片层结构； PrPSC：含有高达50的片层结构，只有20的螺旋。,致病,正常朊蛋白构型发生异常改变后导致疯牛病，无需DNA或RNA的参与，致病因子朊蛋白就可以传染复制。 所谓朊病毒的繁殖就是正常的PrPC蛋白质转变为PrPSC的过程，而且朊病毒感染后也具有指数增长的特性。,1）合成朊病毒所需的信息可能存在于寄主细胞中 朊病毒的作用，仅在于激活在寄主细胞中为朊病毒的编码

9、的基因，使得朊病毒得以复制繁殖。 2）朊病毒的蛋白质能为自己编码遗传信息 发生逆转译产生为朊病毒编码的RNA或DNA，必须存在逆转译酶，甚至还要有逆转录酶。 蛋白质指导下的蛋白质合成，即蛋白质本身可作为遗传信息。,朊病毒的复制机理：,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 二级结构的其他形式 第五节 DNA的超螺旋结构,第二节 核酸的化学组成,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,1 含氮碱基、核苷、核苷酸, 碱基 Nitrogenous bases,DNA: D-2-脱氧核糖 A,G,C,T RNA: D-2-核糖 A,G,C,U,2 核酸

10、的化学组成,核酸的元素组成,C、H、O、N、P（9-10%）,核酸,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,3 DNA的一级结构：即是指四种核苷酸(dAMP、dCMP、dGMP、dTMP)按照一定的排列顺序，通过磷酸二酯键连接形成的多核苷酸也称为碱基顺序。,DNA一级结构的两种缩写方式：,线条式：,pTpGpCpApT pT-G-C-A-T,文字式：,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 二级结构的其他形式 第五节 DNA的超螺旋结构,1 DNA双螺旋模型的提出 2 维持DNA双螺旋的力 3 双螺旋结构的基本形式 4 变性和复性,第三节 DNA的二级结构,1

11、.1 研究背景： 1950年，Chargaff从大量的不同来源的DNA样品的分析中发现了DNA组成的当量规律，即AT，GC，AGCT。 不同生物种属的DNA碱基组成不同， 同一个体不同器官、不同组织的DNA具有相同的碱基组成。,1 DNA双螺旋模型的提出,理论化学家L. Pauling运用化学的简单定律来推理，研究了蛋白质-螺旋结构，此方法启发了Watson和 Crick。 M. Wilkins、R. Franklin等在DNA的X射线晶体结构方面作出了重大的贡献。,R. Franklin的X-射线衍射图,1953年沃森和克里克提出DNA分子双螺旋结构模型。,1.2 DNA双螺旋结构模型的提出

12、：,Fig. 2-5 Watson and Cricks paper in Nature 1953.,1.3 DNA双螺旋结构模型的要点： 脱氧核糖和磷酸通过3,5磷酸二酯键交互连接，成为螺旋链的骨架。 两条链方向以反向平行的方式组成右手双螺旋。, 碱基互补配对：只有A和T配对，G和C配对才能满足正常螺旋（直径20 ）的要求和chargaff的当量规律。, 螺旋参数 螺旋直径nm。 螺旋每旋转一周10对碱基， 每个碱基的旋转角度为36。 螺距3.4nm； 碱基平面之间的距离为0.34nm。, 大沟小沟 对于遗传上有重要功能的蛋白质识别DNA双螺旋结构上的特定信息是非常重要的。 大沟(2. 2n

13、m) 小沟(1. 2nm),1 DNA双螺旋模型的提出 2 维持DNA双螺旋的力 3 双螺旋结构的基本形式 4 变性和复性,第三节 DNA的二级结构,2 维持DNA双螺旋的力,2.1 氢键 GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，这是DNA双螺旋结构的重要特征之一，DNA的许多物理性质如变性、复性以及Tm值等都与此有关。,2.2 碱基堆集力 DNA同一条链相邻碱基之间的非特异性作用力，包括疏水作用力和范德华力。 疏水作用力：不溶于水或难溶于水的两个分子在水中具有相互联合，成串联地结合在一起的趋势。 嘌呤和嘧啶有一定程度的疏水性，双螺旋结构内部形成一个强大的疏水区，使DNA相邻的碱基有相互堆集在

14、一起的趋势，这是形成碱基堆集力的重要因素之一。,范德华力：存在于分子间的一种吸引力； DNA双链中嘌呤环和嘧啶范环德华的半径是1.7 左右 ，其累积的范德华力是相当可观的，这样范德华力加强了疏水作用，这是形成碱基堆集力的另一个重要因素。,氢键与碱基堆集力的协同作用 已经堆基的碱基更容易发生氢键的键合，相应地已经被氢键定向的碱基更容易堆集。 两种作用力相互协同，形成一种非常稳定的结构。如果一种作用力被消除，另一种作用力也大为减弱。,磷酸基团间的静电斥力 带负电荷的磷酸基的静电斥力，所以DNA需要保存在含 Na+ 生理盐条件 。 碱基分子内能 物体的内能是物体内全部分子的分子动能与分子势能之和。

15、温度升高，碱基分子内能增加时，碱基的定向排列遭受破坏，消弱了碱基的氢键结合力和碱基的堆集力，会使DNA的双螺旋结构受到破坏。,2.3 不稳定因素,1 DNA双螺旋模型的提出 2 维持DNA双螺旋的力 3 双螺旋结构的基本形式 4 变性和复性,第三节 DNA的二级结构,3 双螺旋结构的基本形式,三种不同形式的DNA构象,A，B，Z型双螺旋的特性,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽深,大沟不存在,小沟窄而深,A构象:在相对湿度75以下获得的DNA纤维具有不同与B-DNA的结构特点。DNA-RNA杂交分子和RNA-RNA双链结构均采取A构象。 Z-DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤

16、和嘧啶交替排列所造成的，比如CGCGCGCG或CACACACACA。,Z-DNA有什么生物学意义呢? Z-DNA在热力学上是不利的。带负电荷的磷酸根距离太近，产生静电排斥。 DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。 DNA解链是DNA复制和转录等过程中必要的环节，因此Z-DNA的结构与基因调节有关。,B-DNA是活性最高的 DNA构象， B-DNA变构成为A-DNA后，仍有活性，但若局部变构为Z-DNA后则活性明显降低。,三种不同构象的DNA活性,1 DNA双螺旋模型的提出 2 维持DNA双螺旋的力 3 双螺旋结构的基本形式 4 变性和复性,第三节 DNA的二级结构,4 变性和复性4

17、.1 变性(denaturation),4.1.1概念：在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，DNA双螺旋结构松散，变成单链的过程。,4.1.2 常用的变性方法, 热变性, 碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法,4.1.3 核酸变性程度的鉴定紫外测定法： 原理： 嘌呤碱、嘧啶碱存在共轭双键，碱基、核苷、核苷酸、核酸在240-290nm处有强烈的紫外吸收，最大吸收峰在260nm处。,紫外光吸收值： 1 双链DNA A260=1.00 2 单链D

18、NA A260=1.37 3 自由碱基 A260=1.60,1.185,4.1.4 熔解曲线与Tm值 缓慢而均匀地增加DNA溶液的温度（现可做到 0.1 分）可根据各点的A260值绘制成DNA的熔解曲线。,这也是一般PCR实验技术中把变性温度定为94的原因,熔链温度Tm,4.1.5 影响DNA Tm值大小的因素：,DNA的均一性： G-C含量： Tm值计算公式：Tm69.3+0.41 (G+C)% GC%=（Tm-69.3）2.44 介质中的离子强度： DNA保存在高浓度的缓冲液中，如 1mol/LNaCl中。,4.2 复性及杂交,4.2.1 DNA复性(renaturation) 变性DNA

19、在适当条件下，分开的两条单链分子按照碱基互补原则重新恢复天然的双螺旋构象的现象，又称为退火（annealing）。,DNA的复性的条件有两个： （1）有足够的盐浓度以消除磷酸基的静电斥力； （2）有足够高的温度以破坏无规则的链内氢键，但又不能太高， 一般使用比Tm值低2025 。,复性的机制 一般认为需要1020个碱基对，特别是富含GC的节段首先形成一个（或几个）双螺旋核心，这一步叫成核作用。然后两条单链的其余部分就会迅速形成双螺旋结构。 绝大部分的复性DNA分子都不是原配的。,4.2.2 复性的影响因子：,温度和时间：低于Tm值 25左右 (60-65) DNA浓度： DNA片段的大小： D

20、NA顺序的复杂性； 反应溶液中的离子强度。,多聚酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 是一种DNA体外扩增技术，其基本原理类似于DNA的天然复制过程。 在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。,4.3 杂交（hybridization）,杂交：亲缘关系很近的不同来源的DNA单链或RNA单链与DNA单链之间通过碱基互补形成杂交分子的过程。,图核酸杂交及其应用示意图1,粗细线分别代表不同DNA。,杂化双链,B代表天然DNA；C是B的缺失突变体；虚线框内是已缺失的部分,D显示从天然DNA链鼓出小

21、泡.,.突变体的鉴别,I 变性、复性和杂交,.分子探针标记,核酸分子探针： 用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知核苷酸序列作为探针，探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，就可以探知核酸分子。,粗线表示分子探针,图核酸杂交及其应用示意图2,杂交分类： 1）液相杂交：不同来源的DNA在溶液中进行杂交。 2) 滤膜杂交：将DNA或RNA吸附到硝酸纤维素膜上再进行杂交。 Southern杂交：用于鉴别DNA的杂交 Northern杂交：用于鉴别RNA的杂交,Southern 印迹法（Southern blotting）：,DNA,限制片段,限制性内切酶,带有DNA片段的凝胶,琼脂糖凝胶电泳,碱液

22、浸泡，并中和,凝胶上DNA变性,变性的单链DNA转移至硝酸纤维素薄膜上,放射性标记探针杂交,杂交DNA-DNA分子,放射自显影,显示出杂交分子的位置,遗传的物质基础的证明实验 DNA双螺旋结构模型的基本参数 维持DNA双螺旋结构的力 DNA变性、DNA复性、杂交,回顾,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 二级结构的其他形式 第五节 DNA的超螺旋结构,第四节 二级结构的其他形式,1 单链核酸形成的二级结构 2 反向重复与二级结构 3 三螺旋DNA 4 DNA的四链结构,1 单链核酸形成的二级结构,单链核酸的某段碱基可以与另一独立的单链分子的碱基配对

23、，形成双螺旋，可以是DNA-DNA、RNA-RNA，也有DNA-RNA分子杂交。,发夹结构（hairpin structure）： 同一个单链RNA/DNA的一段碱基序列附近存在着和它互补的碱基序列时，这个单链自身回折产生一个反平行的双螺旋结构。,单链RNA形成发夹结构,发夹结构由碱基配对的双螺旋区茎和末端不配对的环构成。,互补序列间间隔较短或无间隔,互补序列间间隔较长,2 反向重复与二级结构 反向重复（inverted repeatitive IR） ：双链DNA中的一段序列按确定的方向，读双链中的每条链的序列都相同， 反向重复中的序列又称回文序列。,单链形成发夹结构,形成十字结构要更耗能，

24、所以在体外反向重复结构存在多，而体内无该结构。,反向重复与十字结构,作用： 1）较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点,例如限制性内切酶 EcoR的识别位点 5GAATTC3 3CTTAAG5,2）转录作用的终止与回文结构也有关系。,第四节 二级结构的其他形式,1 单链核酸形成的二级结构 2 反向重复与二级结构 3 三螺旋DNA 4 DNA的四链结构, 1953 年 Watson & Crick 双螺旋 DNA构型 证明沿大沟存在多余的氢键作为给体与受体,潜在的专一与DNA (蛋白质)结合的能力,形成三链 DNA 可能性,3 三螺旋DNA（trip

25、le helix DNA）,1957年 Felsenfield 发现：当双螺旋DNA中的一条链为全嘌呤链，另外一条链为全嘧啶链时，会出现核酸三链结构。,双螺旋 DNA的概念,三链DNA是由三条核苷酸链按一定的规律绕成的螺旋状结构。,结构单元：三碱基体， 结合方式：碱基间形成氢键；,三螺旋,双螺旋,基本类型： 嘧啶-嘌呤-嘧啶型（YR*Y）：第三条嘧啶链以平行于双螺旋中嘌呤链的方向，缠绕到双螺旋的大沟上，与嘌呤链结合。 如TA*T和CG*C； 其中C必须质子化才能稳定三螺旋的结构，其碱基氢键构造是霍氏（K.Hoogsteen）首先提出，称为Hoogsteen霍氏氢键。 嘌呤-嘌呤-嘧啶（ YR*

26、R）：第三条嘌呤链反平行于双螺旋嘌呤链的方向缠绕到双螺旋的大沟上，与嘌呤链结合； 如CG*G、TA*A、TA*T、CG*A四种。,三链 DNA可能的功能,可阻止调节蛋白与 DNA结合, 关闭基因转录过程,b) 与基因重组, 交换有关,加入第三条DNA 作为分子剪刀, 定点切割DNA分子,d) 加入反义的第三条链终止基因的表达,4 DNA的四链结构(Tetrable Helix DNA ),DNA3-末端较长的富含G序列能够形成回折结构（下图a和b），通过碱基间的非标准配对形成G的四链DNA（下图c和d）。 在这样的结构中，G形成一种四联体，相互间通过霍氏氢键方式结合。,在G-四链体结构中：G-

27、四联体以螺旋方式堆积而成，四个鸟嘌呤构成G-四方体平面，其中每个鸟嘌呤都作为碱基对氢键的供体和受体。 结构单元：鸟嘌呤四联体,类型:,GGGGTTTGGGGTTTGGGGTTT,真核生物染色体端粒DNA结构,可能的功能,A 稳定真核生物染色体结构，抑制端粒酶的活性；,B 保证DNA末端准确复制,C 与DNA分子的组装有关,D 与染色体的减数分裂和有丝分裂有关,第一节 遗传物质的本质 第二节 核酸的化学组成 第三节 DNA的二级结构 第四节 二级结构的其他形式 第五节 DNA的超螺旋结构,第五节 DNA的超螺旋结构(三级结构),1 超螺旋（superhelix OR supercoil）,绝大多

28、数原核生物及病毒的完整DNA分子都是共价封闭环(covalently closed circle, CCC)分子。这种双螺旋环状分子再度螺旋化成为超螺旋， 真核生物线状DNA与蛋白质结合以环状的形成存在。,因此 超螺旋结构是DNA三级结构的主要形式。 超螺旋是有方向的，有正超螺旋和负超螺旋两种。,1.1 超螺旋的成因,共价封闭环状DNA或者与蛋白质结合的DNA中，双链不能自由转动，额外的张力不能释放，导致DNA扭曲来缓解张力，最终形成超螺旋。,1.2 超螺旋结构的方向性 DNA分子无论是闭合还是开放结构，只要缺乏超螺旋结构，称为松旋结构。 负超螺旋：形成超螺旋时，旋转方向与DNA双螺旋方向相反，使得DNA分子内张力减少，使得解旋。 正超螺旋: 刚好相反，形成超螺