分子生物学课件chapter4DNA复制.ppt

1、Chapter 4 The Replication of DNA,Chapter 8 of the book,Introduction,When will the DNA replication happen?,DNA 复制在细胞周期的S期,（4）细菌(E.coli)DNA每个细胞周期只复制一次,1、Semi-Conservative Replication,1958 Meselson-stahl 设计的CsCl超离心试验证实了 DNA复制的这一特性,概念： 复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模 板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子 代DNA分子,15N 标记实验, 细胞生长在15N

2、 标记培养基中 转入正常N源培养基中 分离各代DNA 分析各代DNA的浮力密度,CsCL密度梯度离心 浮力密度 N15DNA 1.742g/ml N15N14DNA 1.717g/ml N14DNA 1.710g/ml,聚合反应： substratedNTP,Poly(核苷酸)n3-OH dNTP Poly(核苷酸)n+13-OH 2Pi,The direction of replication,Correctly paired bases are required for DNA-polymerase-catalyzed nucleotide addition,子链DNA延伸方向只能是53,

3、+,+ ppi, 如果DNA的延伸方向是 3 5,a、因能量的需要， DNA的5 端必须带有PPP,游离dNTP具有ppp,The initiation of a new strand of DNA requires an RNA primer (primase) DNA helicases unwind the double helix in advance of the replication fork Single-stranded DNA- binding proteins stabilize ssDNA prior to replication Topoisomerases remo

4、ve supercoils produced by DNA unwinding at the replication fork DNA polymerase extend the DNA chain,Table 8-1 (factors involved in the replication),1)、 解螺旋酶 （helicase）:又称解旋酶, 通过水解ATP获得能量,解开DNA双链. 2). 单链结合蛋白（SSB): 结合在DNA单链上,有时有协同效应. 3)、 DNA旋转酶 ：消除复制叉前进过程中产生的正超螺旋，产生负超螺旋.,The initiation of DNA replicat

5、ion,（1） OriC in E. coli chromosomal DNA, 四个9bp的重复序列 dnaA结合位点, 三个13bp的重复序列,若干GATC位点,酵母菌的复制起点称为ARS(autonomously replicating sequence)，有100多个bp。ARS包括一个共有序列(A)和附加元件(B1B3)。A功能域为ARS的中心，可能是起始蛋白的结合位点。A的序列为(T/A)AAATA(T/C)AAA(T/A)；A元件在芽殖酵母中高度保守，是复制起始所必需的。其中有富含AT的11bp序列是复制起始识别复合物（origin recognition complex, OR

6、C）结合复制起始位点所必需的，对起始因子在复制起始位点的组装起基本作用。,真核生物（Eukaryote） : 多复制起点 即一个genome中有多个复制单位,The initiation of DNA replication,DnaA is the initiator,primase,an RNA enzyme involved in the replication of DNA. Primase catalyzes the synthesis of a short RNA segment (called a primer) complementary to a ssDNA template.

7、,no known DNA polymerases can initiate the synthesis of a DNA strand without an initial RNA or DNA primer,DNA Ligase,所需条件： a、 切刻的 3OH 和 5P 相邻 b、 切刻各自碱基处于配对状态 c、 需要能量 原核（ATP、NAD） 真核（ATP）,用途： 复制过程中，5 端RNA引物被置换后切刻的连接 修复、重组,DNA polymerase,三种DNA聚合酶的结构和功能,35 exonuclease activity（polymerase I, II, III） 校对功

8、能(proofreading),53 exonuclease activity (polymerase I, III) DNApol的53外切活性有以下三个特点： 必须有5磷酸末端 被除去的核苷酸必须是已经配对的 被除去的可以是脱氧核糖核苷酸，也可以是核糖 核苷酸 （切刻平移）,其中 DNApol 全酶有十种共22个亚基,二聚体 滑动钳,Interaction between DNA and DNA polymerase,The initiation of DNA synthesis in E.coli,2、真核生物的DNA聚合酶,、五种,位置 核内 核内 核内 核内 线粒体,合成 与引发 修

9、复 合成 合成,修复 复制 功能 酶结合 前导链 后随链,35校 NO NO Yes Yes Yes 正活性,Activation of the pre-RC leads to the assembly of the eukaryotic replication fork,The activation of pre-RCs is tightly regulated by cyclin-dependent kinases (Cdks),（3）复制终止,a、终止序列 E.coli 有两个终止区域，分别结合专一性的终 止蛋白 序列一：terE terD terA 序列二：terF terB terC

10、 每个区域只对一个方向的复制叉起作用,b、专一性终止蛋白 E.coli 中由 tus gene 编码 （terminus utilization substance） 通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用 每次复制时只使用一个终止位点,ter,5、复制忠实性的保证,1、DNApol的35外切酶活性 (exonuclease activity),2、DNApol只能从引物的3 端延伸DNA （需要RNA引物） a、碱基配对协同性导致最初几个碱基错配率高， 且不易校正 b、RNA引物最终被降解而避免错误,3、后随链的不连续合成 因其有利于错配碱基的校正,3.6. 真核生物DNA的复制 (DNA re

11、plication in Eukaryote),3. 真核生物DNA复制的引发酶, DNApol + primase形成紧密的复合物, 引发酶（primase）： 50-60kd, 作用方式为阵发性的，每次作用拷贝615个核苷酸, 既能利用NTP，又能利用dNTP, SV40体外DNA复制情况分析,端粒位于真核生物染色体DNA的3末端，由独特的DNA重复序列及相关蛋白组成的复合体。 端粒的功能： 维持染色体的完整性，决定细胞的寿命。若无端粒，两个染色体末端很可能融合一起。 解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度。,端粒的结构 DNA端粒由简单的串联重复序列组成 人和其他脊椎动物：AG

12、GGTT 纤毛原生动物四膜虫：GGGGTT和GGGGTTTT 面包酵母：G13T和G15A 共同特点：富含G；长度达几百到几kb；人类DNA端粒长几kb到几十kb。,端粒酶(Telomerase) 是催化端粒合成的酶。它是由一条RNA和多种蛋白质构成的核糖核蛋白复合体。端粒酶中的蛋白部份具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。,端粒酶的作用机制：端粒酶的RNA分子与端粒DNA配对，以RNA为模板进行类似逆转录合成DNA，向53延伸端粒至模板RNA末端后，延长的DNA末端与RNA模板解离，端粒酶移动，重新定位于延长后的DNA3端，开始下一轮延长过程，如此反复可达数百次

13、合成几百个或数千个重复序列。,（3） 补齐过程,通过TG链的回折形成 发夹结构（GG氢键） 尺蠖模型 实现端粒酶位置的 调整,大多数体细胞不合成端粒酶，每次分裂后端粒就变短（约30200bp）。当端粒比正常的长度短数kb时细胞就不再分裂。所以端粒变短是一种老化的象征。实验证明将端粒酶加进体细胞，可以增加体细胞分裂次数。癌细胞主要特性是能无限期的分裂增生，这需要不断表达端粒酶。实验发现癌细胞的端粒酶活性很强。这点可被用来检验癌细胞。,实验表明人体细胞通过监测失去的端粒的重复数而计数细胞分裂次数，当端粒长度下降到某一临界值时，细胞终止分裂衰老、死亡,“多莉”的衰老,研究端粒丢失的速率，预测人类的寿

14、命,研究推测端粒酶与肿瘤的关系,ColE1质粒DNA的复制是从一个特定的复制起点（ori）开始，并沿着环DNA分子单向性地进行。控制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素RNAI和RNA两种RNA分子，都是由ColE1 DNA转录产生的。其中RNA也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补的模板DNA形成一种杂交分子，被RnaseH酶所切割，从而释放出3-OH末端，作为供DNA聚合酶合成DNA的引物。RNA可以通过同RNA结合，以阻止其与模板DNA发生杂交作用。,原核细胞DNA复制的调控,真核生物的复制起始受许可因子的控制,a、复制子的大小（Sizes of replicon）: Yeast or fly平均 40 kb Mammals 平均 100 kb Prokaryoti