基因诊断与性传播疾病课件模板-008(共30)

1、基因诊断和性传播疾病课件模板-8，基因诊断和性传播疾病：4。淋病对妊娠和新生儿的影响：当女性淋病并发输卵管炎时，可导致不孕。女性淋病导致不孕的发生率约为20%，不孕的发生率随着感染次数的增加而增加。对于感染淋病三次以上的女性，不孕症的发病率可达70%。宫颈淋菌性炎症可导致早期破膜、羊膜腔感染、宫内感染、宫内生长迟缓、早产等。由于早产和低体重，新生儿败血症的发病率和死亡率非常高。基因诊断与性传播疾病：4。淋病对妊娠和新生儿的影响：产后淋球菌上行感染可导致子宫内膜炎、产后发热、产后败血症、新生儿淋球菌性结膜炎和严重情况下的淋球菌性外阴阴道炎。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查：淋球菌实验室检查包

2、括涂片、淋球菌培养检查、抗原检测、药敏试验和PPNG测定、基因诊断。(1)涂片检查：取患者尿道分泌物或宫颈分泌物，进行革兰氏染色，在多形核白细胞中发现革兰氏阴性双球菌。对于有大量化脓性分泌物的单纯性淋菌性尿道炎患者，涂片阳性率约为90%，可初步确诊。女性宫颈分泌物中杂菌较多，敏感性和特异性较差。阳性率只有50-60%，而且有假阳性。因此，世界卫生组织建议使用文化方法来检查女性患者。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查。实验室检查：由于慢性淋病分泌物中淋球菌少，阳性率低，有必要服用前列腺按摩液提高检出率。咽喉涂片中发现的革兰氏阴性双球菌不能诊断淋病，因为其他奈瑟氏球菌属是咽喉中的正常菌群。此外，

3、应进一步检查具有非典型症状的涂片。(2)培养检查：淋球菌培养是诊断的重要依据。培养方法对有轻度或无症状症状的男性和女性患者都敏感。只要培养结果是阳性的，就可以确诊。在基因诊断出现之前，培养是世界卫生组织推荐的唯一筛查淋病的方法。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：目前，国外推荐选用改良的泰尔-马丁培养基和纽约培养基。中国使用的巧克力琼脂或血琼脂培养基含有抗生素，可以选择性地抑制许多其他细菌的生长。在36，70%湿度和5%-10%CO2(蜡烛罐)中培养24-48小时。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：培养后应进行菌落形态、革兰氏染色、氧化酶试验和糖发酵试验。

4、男性培养阳性率为80%-95%，女性为80%-90%。(3)抗原检测1。固相酶免疫分析法：可用于检测临床标本中的淋球菌抗原。它可以用在流行率高的地区，但不能培养或标本需要发送很长时间。它可用于诊断女性淋球菌感染。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查。直接免疫荧光试验：直接免疫荧光试验是通过检测淋球菌外膜蛋白的单克隆抗体来进行的，但目前男女标本的灵敏度和特异性不高，实验者的判断水平较差，因此本实验不推荐用于诊断淋球菌感染。(4)基因诊断1。淋病奈瑟菌基因探针诊断用于淋病奈瑟菌基因探针诊断的探针包括质粒DNA探针、染色体基因探针和rRNA基因探针。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检

5、查。5.实验室检查：(1)质粒DNA探针隐藏质粒DNA探针。淋球菌质粒分为三种类型：最大分子为36kb的接合质粒；耐药质粒包括两个长度分别为5.6kb和7.1kb的质粒；分别是。隐藏质粒4.2kb其中，隐藏质粒存在于96%的临床淋病奈瑟菌分离株中，而其他奈瑟菌不含该质粒，因此其序列可作为检测淋病奈瑟菌的特异性DNA探针。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查。实验室检查：Torres采用核酸杂交技术检测淋病奈瑟菌，所用探针为隐藏质粒。用该探针检测134株淋球菌和131株相关菌株，124株淋球菌杂交反应阳性，占93%，并能与其他淋球菌发生交叉反应。对检测探针的敏感性试验表明，可以检测到淋病奈瑟菌的

6、102菌落。研究证明隐藏质粒中的CPPB基因序列存在于所有淋病奈瑟菌染色体中(包括不含质粒的菌株)。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：可见，CPPB基因探针具有良好的特异性和敏感性。Torres等人用CPPB基因探针检测了201份临床标本，采用非放射性地高辛标记系统，灵敏度和特异性分别为95%和98%。耐药质粒DNA探针淋病奈瑟菌的耐药质粒可分为：产氰产毒淋病奈瑟菌(PPNG)，具有阳性内酰胺酶；具有高水平的质粒介导的耐四环素淋球菌(TRNG)。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查。实验室检查：PPNG菌株于1976年首次在实验室分离。它含有编码蓝绿色酶的基因，这些基因可以

7、整合在染色体上或出现在质粒DNA中，后者通常被称为蓝绿色酶质粒。有两种质粒，大小分别为7.4kb和5.3kb。Pescador1998于1998年设计了一种检测淋病奈瑟菌编码内酰胺酶基因的特异性探针，该探针经酶化学发光标记，液相杂交，光度测定。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查：4小时内可检出104-105CFU PPNG菌株。尽管TRNG菌株对四环素有耐药性，但它们通常对-内酰胺酶和喹诺酮类药物敏感。因此，在实验室药敏试验中可将其归类为敏感菌。Pescador使用耐四环素淋球菌(TRNG)tetm基因的寡核苷酸探针，其介导四环素抗性。酶化学发光法标记，液相杂交。在4小时内，可从临床标本中直

8、接检测到1.5104个含四环素基因的淋病奈瑟菌菌落。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查，5。实验室检查：(2)染色体探针包括已知功能的基因探针，如菌毛DNA探针和paI基因探针，它们在人类细胞淋球菌感染过程中起重要作用；功能未知的基因探针。这些探针序列与特定的染色体序列互补，但这些基因序列的功能目前尚不清楚。由于淋病奈瑟菌互补序列的低拷贝数和低检测灵敏度，这两种染色体探针除非有特殊研究目的，否则不常用。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：(3)rRNA基因探针以与rRNA互补的DNA为探针，探针的靶序列为rRNA序列。rRNA基因探针的特点是：可以提高探针检测的灵敏度，rR

9、NA基因探针可以同时检测rRNA分子和DNA分子；RRNA在进化上是保守的。杂交方法简单快速。由于rRNA含量高，样品不需要富集。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查。实验室检查：美国Gen-Probe公司生产的淋球菌检测探针PACe C使用rRNA及其基因作为检测靶序列，可在2小时内检测出来。彼得用该探针检测了395份临床标本，灵敏度和特异性分别为92.9%和99.4%。他认为起搏器系统筛选临床标本。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：该探针还可以检测无症状的淋球菌感染，这在当前的培养中很难实现。2.淋病奈瑟菌的基因扩增检测虽然上述探针技术与培养方法相比，在灵敏度、特异性和

10、方便性方面有了很大提高，但仍有一定的局限性。例如，在大多数情况下，样品中淋球菌的浓度非常高，而聚合酶链反应技术和连接酶链式反应的出现进一步提高了检测淋球菌的灵敏度。它具有快速、灵敏、特异、简便的优点，可直接检测临床样品中的极少量病原体。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：(1)淋病奈瑟菌的DNA提取将培养的淋病奈瑟菌溶于浓度为102cfu/ml的碱性裂解液中，该裂解液由1m的氯化钠和1%的十二烷基硫酸钠组成。将裂解物混合均匀，煮沸1分钟，用100升1毫升的pH7.0中和碱性裂解物。实验室检查，5。实验室检查：用Tris平衡酚提取一次，用酚氯仿提取一次，然后用无水乙醇或异丙醇沉

11、淀DNA，将提取的DNA溶于30l蒸馏水或te缓冲液中。临床棉签标本提取：将分泌液的棉签在2ml无菌生理盐水或PBS缓冲液中挤压洗涤1分钟，使标本尽可能溶解在溶液中，弃去棉签，以2-3000转/分钟的速度离心悬液5分钟，吸去上清液，将细胞重新溶解在100l含0.45%吐温20和200g/ml蛋白酶K的1PCR缓冲液中，将细胞悬液在50-60下浸泡1小时，然后在95下加热10分钟至10分钟基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：(2)聚合酶链反应引物的设计由于淋病奈瑟菌的CPPB基因隐藏质粒存在于淋病奈瑟菌的染色体和4.2kb的隐藏质粒中，并且这种隐藏质粒存在于96%的淋病奈瑟菌中

12、，所以在CPPB基因区设计了许多聚合酶链反应引物。目标基因引物序列片段的长度15 gtt tggctggtt GATT CA ag3633 ng 25 gcaga TTT ccg attt ggc g3cppbho15 gctacg catac CGC GTT GC 3 390 ho25 cgaaga CCT CG AGC AGA CA3 rRNA引物15-AGG CTG TTG CCA ATA TCG GC-3 206引物25-ACA CTC gagt CA CCC AGT TC-3 cppb gc15 CTT ATC gtttgg CTG GTT gat TC3 435 gc2 5a cc

13、 AAG 聚合酶链反应扩增，取2l淋病奈瑟菌DNA提取物，加入到28l反应液中，最终的聚合酶链反应反应液中每份含有100毫升脱氧核糖核酸。 0.5摩尔/升引物，1U TaqDNA聚合酶，1.5摩尔/升Mg2，30升无菌石蜡油，以1000转/分钟离心30秒，聚合酶链反应扩增循环，反应条件：94变性1分钟，然后9430秒，571分钟，721分钟。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：总共30个周期，最后72个周期延长5分钟。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳30分钟，并用溴化乙锭染色。扩增的DNA荧光带在紫外灯下可见，分子大小应与引物扩增的靶序列大小一致。(4)聚合酶链反应的敏感性和特

14、异性由于CPPB淋病奈瑟菌染色体上也含有CPPB基因，没有隐藏质粒，加上96%的淋病奈瑟菌会有隐藏质粒，以CPPB为靶序列的引物具有极高的敏感性。实验表明，常规一步聚合酶链反应(GC1-GC2)可检测出三种淋球菌，而单管套式聚合酶链反应(GC2-GC4)可检测出0.3种淋球菌基因诊断和性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：这些引物只能扩增淋病奈瑟菌的DNA，但不能扩增非淋病奈瑟菌的特异性产物。(5)在传统套式聚合酶链反应的基础上，单管套式聚合酶链反应方法特别设计了两对聚合酶链反应引物。外部两个嵌套引物(GC1，GC2)是具有较高退火温度(68)的25b，内部两个嵌套引物GC3-GC4是具

15、有较低退火温度(46)的17b。聚合酶链反应反应液的其他成分与普通聚合酶链反应相同。基因诊断和性传播疾病：5。实验室检查，5。实验室检查：这样，通过控制退火温度(68)，首先扩增外引物，经过20-30个循环(第一次聚合酶链反应)，通过降低退火温度(46)嵌套内引物，该聚合酶链反应的灵敏度可达到0.3淋病奈瑟菌。(6)淋球菌连接酶链反应检测方法目前，淋球菌的聚合酶链反应检测方法被广泛使用。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：其特异性和敏感性不断提高。同时，另一种基因诊断技术连接酶链式反应(LCP)也以其高特异性和高灵敏度应用于淋病奈瑟菌的检测。LCp和聚合酶链反应的区别在于LC

16、p使用四对引物，所用的酶是连接酶。连接酶可以连接两个相邻的引物。两个连接的引物可以作为另外两个引物的模板，在连接酶的作用下连接，也可以作为模板，如此循环30-40次。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查：LCP中使用的模板处理方法与PCR模板制备中使用的方法相同。LCP中使用的探针不仅可以设计在CPPB基因上，还可以设计在染色体基因序列上，如opa-1基因。美国雅培实验室在opa-1基因的48bp长区域设计了四个LCP探针，因为opa-1基因在淋病奈瑟菌染色体中有11个重复。因此，这组LCP探针具有较高的灵敏度和特异性。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查：LCP反应过程：向L

17、CP反应溶液中加入模板，LCP反应溶液：20摩尔/升Tris-HCLPH 7.6；100毫摩尔/升KCl 10毫摩尔/升氯化镁；1毫摩尔/升乙二胺四乙酸；10毫摩尔/升NAD10毫摩尔/升DTT，40毫摩尔/升用于两个带有标记的相邻探针，40毫摩尔/升用于未标记探针，15U耐热连接酶，反应条件：971s，551s，6250s，40个循环。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查：将100升反应产物加入酶标板的微孔中进行显色反应，最后用酶标仪读取光值。根据Buimer的实验，LCP检测男性尿道拭子标本的灵敏度为100%，尿液标本为88.9%，女性宫颈拭子标本为95.4%。LCP法的特异性高达100%，明显高于PCR法，避免了假阳性的发生。基因诊断与性传播疾病：5。实验室检查；5.实验室检查。淋球菌临床基因诊断注意事项目前，淋球菌临床检测的基因诊断方法主要采用聚合酶链反应方法，但该方法在临床检测中应注意几个问题。(1)引物设计除了上面列出的淋球菌聚合酶链反应引物之外，还可以从其他基因设计，但引物序列应该是特异性的。因