转基因工程试验流程.ppt

1、基因工程实验流程概述、DNA提取、纯化、限制性图谱、琼脂糖电泳检测片段、体外扩增聚合酶链反应、靶基因制备、载体选择、DNA重组片段连接、未知核酸序列、DNA片段大小估计、互补粘性非互补粘性末端平端、限制性内切酶消化分离方法简单基因组分离如质粒和病毒、物理和化学方法、基因组文库构建、聚合酶链反应扩增、基因化学合成、双抗体免疫分析、酶反应基因-cDNA、靶基因分离、 转座子基因定位克隆酵母双杂交、预处理防止自连接、核糖核酸提取、逆转录聚合酶链反应、聚合酶链反应产物回收、感受态细胞转化、基因组文库构建。 真核生物有数千个碱基对，单个未知基因在整个基因组中的比例很小，不能在体外特异性扩增，所以所有基因

2、只能扩增，即可以构建基因组文库。油菜TOC33基因片段的克隆，实验项目背景(油菜叶绿体蛋白转运突变体差异表达基因的克隆，编号30170500)。实验目的通过本综合实验，我们可以掌握植物基因组DNA的制备技术、聚合酶链反应技术、限制性酶切技术、重组DNA技术、克隆与鉴定技术、质粒DNA制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等。并获得类似于科学研究过程的分子生物学综合技能训练。具体实验步骤，植物基因组DNA的制备，TOC33基因片段的聚合酶链反应扩增，琼脂糖凝胶上DNA的回收和纯化。DNA片段的体外重组和转化五、克隆六的筛选和鉴定。序列分析，植物基因组DNA的制备，取0.2克样品幼叶，置

3、于1.5毫升试管中，液氮冷冻，在试管中充分捣碎，加入0.6毫升提取缓冲液，660.5%。以12000转/分钟离心3分钟，取上清液，加入经二倍体产物预冷却的无水乙醇沉淀，如有絮状沉淀，以4000转/分钟离心5分钟。用50ul te-RNase (5.0mm tris)溶解沉积物。盐酸浓度为8.0，乙二胺四乙酸浓度为1.0，核糖核酸酶浓度为30微克/毫升)，在37孵育15分钟。加入经二倍体体积预冷的无水乙醇，在-20下沉淀10分钟，在4000转/分钟下离心3分钟，沉淀用适量70%乙醇洗涤，自然干燥或在37下干燥，加入50微升ddH2O溶解备用。TOC33基因片段的聚合酶链反应扩增，引物设计，为了扩

4、增Toc33片段，用寡核苷酸0 5设计了一对聚合酶链反应引物：上游引物P1:5-atggtctctcgttcgtgaat-3和下游引物p2:5-TTAAGTGGCTTTCCATCTTGTC-3。0 .在0.2微升管中制备25微升反应系统：10聚合酶链反应缓冲液2.5微升Mg2 1.5微升dntp 1.0微升引物1.0微升引物2 1.0微升Taq酶0.5微升模板1.0微升ddH2O 16.5微升1)94变性5分钟2)94变性30秒3)55退火30秒4)72延伸45秒5)重复步骤2)-4)30次6)72延伸10秒用琼脂糖凝胶电泳分析聚合酶链反应结果1)称取0.5g琼脂糖，放入溶胶瓶中，然后加入1m

5、l 50TAE缓冲液和49ml高水，放入微波炉或水浴中。 2)将橡胶板放入电泳槽内，用胶带封好两端，整平，将样品梳放好。3)将冷却至60左右的琼脂糖凝胶溶液缓慢倒入胶板中，直至胶板上形成均匀的胶面。4)凝胶固化后，取出梳子放入电泳槽中。电泳缓冲液应加入电泳槽中。5)用移液管枪将加入了装载缓冲液的聚合酶链反应产物加入装载孔。6)打开电泳槽和电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极移动到正极)；选择合适的电压并开始电泳；7)当溴酚蓝燃料移离凝胶前言12厘米时，停止电泳。8)将电泳凝胶浸入溴化乙锭染色液中，染色10分钟后取出，用清水冲洗。将凝胶放入凝胶成像系统中拍照，以便观察样品在琼脂糖凝胶中的条

6、带(EB毒性很大，所以要戴手套操作)。电泳染色后，在紫外分析仪上切割所需的条带，加入提取缓冲溶液然后将溶液转移到试剂盒的专用试管中，以6000转/分的速度分离心脏1分钟；倒出上清液，加入500微升提取缓冲液，以12000转/分钟离心1分钟；倒出上清液，加入750微升洗涤缓冲液，以12000转/分钟离心1分钟；倒出上清液，重复第三步；倒出上清液，以12000转/分钟的速度静置1分钟；将带膜的试管放入新的极压试管中，加入3050微升水，静置1分钟，以12000转/分钟的速度离心1分钟，获得待回收的碎片。该样品可用于酶消化。琼脂糖凝胶上DNA的回收和纯化。体外重组DNA片段，自上而下加入试剂(装在5

7、00微升极压管中)，加入后混合均匀，离心短时间，用密封胶密封。将电生理管放入金属浴中，在37度下进行酶消化约两个半小时，取出酶消化产物，用连接反应试剂盒敲击进一步纯化酶消化片段。酶消化系统：40.0微升ddh2o9.0ul微升10缓冲液4.0微升DNA 25.0ul微升xba 1，1.0微升Hind III 1.0ul微升，连接反应：连接系统：(20.0微升)酶消化产物3.0微升缓冲液1.0微升载体14.0微升Liagse 2.0ul微升，试剂添加顺序自上而下(包装在500微升电泳管中)。将电生理导管置于金属浴中，并在16度下连接过夜。四。脱氧核糖核酸片段的转化。从液氮中取出感受态细胞，将它们

8、完全融化，用移液管将连接产物加入感受态细胞中，轻轻混合，放在冰上半小时。2.42OC热冲击90秒。将它们在冰上放置10分钟，然后引入到有机玻璃(1.5毫升试管)中，并在37的摇动器上以200转/分钟的速度摇动1小时。3.在此期间，可以制备平板，并且将大约25毫升具有大约60度的抗生素的LB固体培养基倒入预先灭菌的培养皿中，并且表面涂覆有X-gal和ITPG4.取出振荡的细菌液体，在离心机中以6000转/分钟的速度离心5分钟。然后，倒出大部分培养基，剩余约50微升有机碳。小心不要倒出沉淀物。5.用移液管枪将沉淀物吹匀，加入到预先倒入的盘中，并加入涂层玻璃珠进行涂层。均匀涂布后，将平板倒置于37培

9、养箱中过夜培养。第二天，从转化的平板上挑出白色菌落，以验证它是否是阳性克隆。五、克隆1的筛选和鉴定。用移液管枪将500微升液体LB培养基加入1.5微升试管中，然后用无菌牙签从长有蓝点和白点的平板中挑出阳性克隆，并将其放入EP试管中，弃掉牙签，将管口盖紧，用报纸包好，放入37和200转/分钟的摇床中过夜培养；2.2。EP管混浊，因此质粒通过质粒提取试剂盒提取。3.对于再酶切电泳检测到的阳性克隆，如果酶切后电泳图上出现与插入片段大小相对应的条带，则证明该单个菌落为阳性克隆，否则为假阳性。在试剂盒的质粒回收过程中，过夜培养液以10000转/分钟离心1分钟，弃去上清液；向菌体中加入400微升质粒回收试

10、剂盒中的溶液一，振荡至沉淀的菌体完全悬浮；然后加入400微升的溶液II，轻轻颠倒混合，然后在室温下放置2分钟；加入525微升溶液III，倒置混合直至出现白色絮状沉淀，以10000转/分钟离心10分钟；将上清液转移到试剂盒的专用试管中，以10000转/分钟的速度离心1分钟；倒出溶液，向试管中加入600微升缓冲液HB，以10000转/分钟离心1分钟；倒出溶液，加入750微升洗涤缓冲液，以10000转/分钟离心1分钟；重复前面的步骤7次；清空溶液一次，以尽可能多地去除残留的洗涤缓冲液；将带膜的试管转移到新的极压试管中，加入100微升水，静置1分钟，以10000转/分钟的速度离心1分钟，得到所需的质粒

11、。六。序列分析，将获得的阳性单克隆样品送去测序，测序结果的同源性用GenBank中的BLAST分析程序进行比较，基因序列用DNAsist软件进行比较。实验起始材料的选择和制备，mRNA的提取，纯化靶片段的克隆和分析，克隆基因表达的提取、纯化和分析，表达蛋白的纯化和功能分析，基因转化实验和转基因结果分析，1。实验起始材料的选择和制备，大米卵细胞的分离，分离的制备，材料的快速冷冻和长期保存，人工气候箱和制冰机，洁净工作台，显微操作系统，无核糖核酸酶消耗品，液氮罐，超低温冰箱，核糖核酸酶抑制剂，提取和纯化鸡蛋的信使核糖核酸，寡特克斯系列试剂盒，细胞裂解，均质化，脱蛋白和细胞残余，温浴和组合，洗脱，脱

12、盐和回收。离心机、涡流混合器、200个烤箱、DEPC、不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶1、不含核糖核酸酶的耗材、3。克隆和分析目标片段，利用SMART基因文库构建试剂盒构建水稻卵细胞基因文库；目标基因的获得；通过噬菌体载体自切割或T-载体和平端载体克隆获得目标质粒。用测序仪和通用引物对克隆的目的基因进行测序；1.利用SMART技术构建cDNA文库，包括第一链的合成、第二链的合成和扩增、酶消化、纯化和片段分离、cDNA检测、插入载体和包装、文库质量检测、文库扩增和保存、恒温水浴、制冰机、RTase、核糖核酸酶抑制剂、聚合酶链反应仪、高保真Taq酶、恒温水浴、离心机等电泳仪、凝胶成像系统、琼脂糖、恒

13、温水浴、洁净工作台、烘箱、聚合酶链反应仪、培养基、超低温冰箱、DMSO、2。克隆靶基因，使用特异性探针，使用核酸杂交或使用特异性抗体，通过抗原-抗体反应筛选文库中的靶基因，在平板上培养噬斑，在杂交盒中与特异性探针杂交。最后，在恒温振荡器中清洗膜(探针标记：放射性和非放射性)，并在平板上培养噬菌体。在42培养数小时后，融合蛋白被IPTG诱导并在37标记在尼龙膜上，目标基因通过使用GSP(基因特异性引物)的聚合酶链反应扩增。目的基因以GSP和文库为模板，经PCR扩增，电泳和凝胶成像系统检测。利用文库载体序列和已知的靶基因序列设计通用引物和GSP，用5RACE和3RACE扩增靶基因的5末端和3末端序

14、列。通过电泳和凝胶成像系统检测。用5RACE和3RACE克隆已知部分序列的目的基因；4.提取、纯化和分析脱氧核糖核酸和核糖核酸，获得含有目的基因的质粒；对于通过筛选文库技术获得的靶基因，通过噬菌体载体的自切割作用产生靶质粒。水稻基因组DNA的提取、纯化和分析从水稻各种器官中提取、纯化和分析总核糖核酸，质粒提取和分析，常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放质粒，用苯酚和氯仿提取蛋白质，用无水乙醇沉淀质粒DNA。裂解结束后，通过过滤柱纯化质粒DNA，提取质粒后，根据以后实验需要，使用不同的限制性内切酶在水浴中进行酶切电泳，使用凝胶成像系统进行分析和测序，进行水稻基因组DNA的提取、纯化和分析。用

15、SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂盒提取水稻基因组DNA:在高钾离子浓度条件下，用SDS沉淀蛋白质、多糖等杂质提取基因组DNA，用酚-氯仿萃取或过滤柱纯化基因组DNA，用特异性探针通过Southern印迹检测目的基因的拷贝数。从水稻的各种器官中提取、纯化和分析总核糖核酸，分离所需的水稻器官和组织，并通过Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总核糖核酸：将材料裂解后，在无核糖核酸酶的条件下通过过滤柱纯化总核糖核酸，通过使用特定探针的甲醛变性凝胶电泳检测总核糖核酸质量，通过Northern印迹检测各种器官中靶基因的表达，基因组DNA的完全消化，探针制备，琼脂水平电泳， 比活测定、印迹膜转

16、移、DNA交联、限制性内切酶、恒温水浴罐、便携式紫外灯、电泳仪、真空膜转移仪、紫外交联仪、同位素检测器。 探针制备试剂盒、尼龙膜、制备尼龙膜、探针(放射性或非放射性)、杂交、杂交盒、放射自显影、荧光、同位素检测器荧光屏成像系统、荧光扫描成像系统、克隆基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析、克隆基因表达蛋白的纯化功能分析、基因克隆：采用高保真Taq酶和适当的反应系统，通过聚合酶链反应(经测序证实)获得与靶基因完全一致的DNA片段，并在体内表达；选择合适的表达载体来插入靶片段。通过化学方法或电转化仪器，如兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等，转移到细胞表达的体外转录和翻译系统中。表达蛋白的纯化，SDS聚丙烯酰胺凝胶的回收，用SDS聚丙烯酰胺凝胶分离不同大小的蛋白质。用6HIS、谷胱甘肽等纯化。和亲和树脂：通过表达靶基因的融合蛋白，用亲和层析、自动核酸/蛋白纯化工作站洗脱靶蛋白，对靶蛋白进行功能分析，抗体制备：多克隆抗体和单克隆抗体的DNA-蛋白相互作用研究：凝胶移位实验、蛋白磷酸化分析、酵母单杂交系统和其他蛋白-蛋白相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术、体内蛋白表达研究