实时荧光定量PCR技术与原理

1、,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),实时荧光定量PCR,实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR

2、进程，最后通过标准曲线和Ct值对未知模板进行定量分析的方法 。,实时荧光定量PCR原理定量原理,介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍,即：threshold = 10 SDcycle 6-15 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值

3、，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,讲 座 提 纲,实时荧光定量PC

4、R原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon,实时荧光定量PCR 原理 -DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green法 工作原理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和

5、延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 法 融解曲线分析,SYBR Green 法-PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 优缺点,实时荧光

6、定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q),TaqMan法工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过

7、温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,定量方法,绝对定

8、量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相）,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,标准样品DNA拷贝数,用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释,实时荧光定量PCR法 绝对定量方法,相对定量方法,主要有两种:Delta-deltaCt法和双标准曲线法。 由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析

9、的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些内标基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个内标基因。,相对定量方法,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,相对定量方法- Delta-deltaCt法,相对定量方法- Delta-deltaCt法,在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线,如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，

10、那么后续实验中就可以用Comparative Delta-delta Ct法进行相对定量分析。 反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。,相对定量方法- Delta-deltaCt法,1. Comparative Delta-delta Ct法的一大特点是，每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。 2. 当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。,相对定量方法- Delta-deltaCt法,相对定量方法-双标准曲线法,公式：,1. 双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-