EGFP在大肠杆菌E.coli中的表达与检测.ppt

1、EGFP在大肠杆菌中的表达与检测3组，内容，第几章，一、背景介绍，1，绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白)2、质粒3、大肠杆菌表达载体及表达系统4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理及蛋白分离与检测，一，1，绿色荧光蛋白，1.1，发现，下村修，马丁-查尔菲，钱学健，发现绿色和平组织，发光的遗传标签，科研，一，1，绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白)，1.1，发现，GFP的分子质量为26千道尔顿，晶体结构如左图所示。蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长420纳米，宽240纳米，由11 个围绕中心螺旋的反平行折叠组成，荧光基团的形成就是从该螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光活

2、性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第6567位的丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸自身环化和氧化形成，一，1，绿色荧光蛋白（绿色荧光蛋白)，1.2，特性，一，GFP在紫外光激发下发绿色荧光的最高吸收峰为395纳米，另一小吸收峰为470纳米，最大发射峰为505纳米。1，绿色荧光蛋白，1.2，特性，一，1，绿色荧光蛋白，1.2，特性，优点：易于检测，荧光稳定，无毒害，通用性，易于构建载体，活细胞观察，一，1，绿色荧光蛋白，1.3，应用，一，2，质粒，2.1，pEGFP-N3质粒，一，2，质粒，2.1.1，pEGFP-N3质粒描述pEGFP-N3编码野生型绿色荧光蛋白(13)的红移变体，该变

3、体已经针对哺乳动物细胞中更亮的荧光和更高的表达进行了优化(激发最大值=488纳米；发射最大值=507 nm .pEGFP-N3编码GFPmut1变体(4)，其包含Phe-64到罗马尼亚的货币单位和Ser-65到Thr的双氨基酸取代EGFP基因的编码序列包含190多个沉默碱基变化，这些变化对应于人类密码子使用偏好(5).EGFP侧翼序列已被转化为科萨克共识翻译起始位点(6)，以进一步提高真核细胞中的翻译效率。在N3，巨细胞病毒位于巨细胞病毒的早期启动子和EGFP编码序列之间。如果克隆到计算机科学硕士中的基因与EGFP在同一个阅读框架中，并且没有插入的终止密码子，那么它们将会以融合体的形式表达到E

4、GFP的N末端EGFP基因下游的SV40聚腺苷酸化信号指导EGFP基因3末端的正确加工。载体骨架还包含SV40起源，用于在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中复制。由SV40早期启动子、Tn5的新霉素/卡那霉素抗性基因和来自单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)基因的多聚腺苷酸化信号组成的新霉素抗性盒(Neor)允许使用G418选择稳定转染的真核细胞。该盒上游的细菌启动子在大肠杆菌中表达卡那霉素抗性pEGFP-N3主链还提供了在大肠杆菌中繁殖的公用事业委员会复制起点和单链脱氧核糖核酸生产的第一子代起点，一，2，质粒，2.1.2，pEGFP-N3质粒应用融合到EGFP的N末端保留了天然蛋白的荧光特性

5、，允许融合蛋白在体内定位。目标基因应该被克隆到pEGFP-N3中，以便它与EGFP编码序列在一个框架内，没有插入的框架内终止密码子。插入的基因应该包括起始的ATG密码子。可以使用任何标准转染方法将重组EGFP载体转染到哺乳动物细胞中。如果需要，可以使用G418 (7)选择稳定的转化体pEGFP-N3也可以简单地用于在感兴趣的细胞系中表达EGFP(例如，作为转染标记).一，2，质粒，2.1.3，pEGFP-N3质粒图谱，675bp1394bp，pEGFP-N3质粒是一个用于在哺乳动物细胞系中表达EGFP融合蛋白的质粒，它编码GFPmut1突变体，发生了两个氨基酸的替换。pegfp-n3的EGFP

6、、Leu、Phe-64、Ser-65、Thr、的荧光强度增加了35倍、质粒，2.1.5 651独特的地点显示在圆形地图上。请注意，序列是按照p BR322惯例编号的，因此T7表达区在圆形图上是反向的。由T7 RNA聚合酶转录的编码链的克隆/表达区如下所示。f1起点被定向，以便用辅助噬菌体感染将产生包含对应于编码链的单链DNA的病毒体。因此，单链测序应使用T7终止子引物(cat。编号69337-3)。1，2-，质粒，2.2.2，pET28a质粒图谱，卡那霉素抗性，1，2-，质粒，2.2.2，pET28a质粒图谱，1，3-，大肠杆菌表达载体和表达系统，3.1，表达系统，常见的大肠杆菌表达系统如下：

7、T7表达系统：T7噬菌体核糖核酸聚合酶可以选择性地激活T7噬菌体启动子的转录，其核糖核酸合成速率是大肠杆菌核糖核酸聚合酶的35倍。Lac表达系统是-半乳糖苷酶编码基因lac Z的转录控制序列，启动子可以被IPTG诱导，因此可以通过向培养基中添加舒适诱导剂来诱导目的基因的表达。Tac表达系统是由Lac和Trp启动子组成的杂交启动子，其强度得到了很大的提高，并且还可以被IPTG诱导。PL表达系统是负责DNA转录的启动子之一，并且是非常强的启动子。一个完整的大肠杆菌表达系统必须至少由两部分组成：表达载体和宿主细菌。1，3-，大肠杆菌表达载体和表达系统，3.2，大肠杆菌表达系统，用于表达重组蛋白的大肠

8、杆菌具有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不像哺乳动物细胞系统那样昂贵。有多种大肠杆菌菌株和具有不同特征的质粒可供选择。由于缺乏修饰、糖基化、磷酸化和其他翻译后加工，在大肠杆菌中表达的蛋白质经常形成包涵体，这影响了所表达蛋白质的生物活性和构象。原核表达载体通常是质粒。典型的表达载体应该具有以下元件：1，3-，大肠杆菌表达载体和表达系统，3.3，原核表达载体，选择标记的编码序列，可控转录的启动子，转录控制序列(转录终止子，核糖体结合位点)，多限制性位点接头，和宿主中的自我复制序列。大肠杆菌表达载体和系统，3.4，实验表达系统，表达系统，1，3-，大肠杆菌表达载体和表达系统，3.4，实验表达系统，该菌株具有太多的内源蛋白酶，这可能导致外源表达产物的不稳定性，因此一些蛋白酶缺乏的菌株常常成为理想的初始表达菌株。经典的BL21系列是lon和ompT蛋白酶缺乏。BL21(DE3)是由LacUV5启动子控制的T7噬菌体核糖核酸聚合酶基因的溶原细菌，pET28a是带有His标签的表达质粒，它利用T7核糖核酸聚合酶系统在大肠杆菌中以可诱导的方式表达外源